一、配制流动相

以下因素与用于洗脱含有肽及蛋白质的样品的流动相的制备有关。

1.配制各1L的洗脱液A(弱流动相）和洗脱液B(强流动相）。例如：

洗脱液A:0.1%TFA水溶液

洗脱液B:含0.09%TFA的60%乙腈水溶液（体积分数）

有机溶剂和水必须分别用两个量筒来量，然后再混匀，因为混合时体积将会减小，最多每升可减少30ml(具体由溶剂的特性决定）。如果没有按正确方法配液，将会导致流动相成分比例的偏差。

当用水/有机溶剂进行梯度洗脱时，为补偿基线的变化（因为有机溶剂在短波下吸收更多的光），通常要减小洗脱液B中的离子对试剂的量(TFA，H3P04)。与洗脱液A相比，一般减小10%?15%(Dolan,1999)，以得到平坦的基线。

要点：用于蛋白质测序的TFA，因其含有抗氧化剂而不适用于RPHPLC样品的洗脱。

2.在有塞量筒内摇动混匀溶液，或用Teflon包被的磁转子搅拌均勻（时间依溶液体积而定）。

注意：在任何情况下都不能用封口膜封闭装有RP-HPLC洗脱液的长颈瓶或量筒。因为有机溶剂和洗脱液中的酸性离子对试剂会溶解封口膜，使色谱出现非特异的峰：

3.用0.2umPTFE过滤器过滤洗脱液A和B。

过滤洗脱液可延长柱寿命，并有助于排气。

4.未用的洗脱液瓶子用塞子密封，以防有机溶剂蒸发。

二、蛋白质样品的制备

1.用终体积一半的洗脱液A溶解样品，达到所需浓度。如果样品不易溶，则加人少量（<25%总体积）洗脱液B。

少量强流动相将造成样品的预洗脱，洗脱程度由进样环大小、柱内径、流动相梯度的起始成分决定。

2.检测样品纯度。如果含有不溶的乳光物、蛋白质或固体颗粒，则要用0.2/umPTFE滤器过滤样品，或者离心取上清液加样。

警告：如果样品未完全溶解则不能上样，否则会堵塞加样器和层析柱。

3.样品应存放于4°C或一20°C，可依预计保存的时间和使用情况而定。肽和蛋白在室温下会发生降解。

应避免样品的反复冻融，将样品分装成小包装于一20°C保存，每次取出一份使用。

三、检测HPLC系统中的仪器

以下实验步骤与检测适用于分离多肽和蛋白的HPLC系统。

1.在与分离目的肽或蛋白样品相同的条件下，做一组空白对照（用洗脱液A进样），以梯度l00%A—100%B洗脱。如果出现峰，则要重复该步骤。

该步骤旨在清洗前次分离多肽和蛋白时没能被洗脱的杂质。

2.用硫脲或硝酸钠（或其他不会导致交叉影响的溶剂）来测量柱的死体积。

3.用梯度洗脱和适当的测试用混合物来检测柱的工作性能。

例如下面的测试混合物：1.5g/L二甲基邻苯二甲酸，1.5g/L二乙基邻苯二甲酸，0.1g/L联苯，0.3g/L邻三联苯，3.2g/L邻苯二甲酸二辛酯(用甲醇溶解）。

通过检测能评价柱床完整性[低完整性与峰的分裂、峰的前伸（fronting)或拖尾有关]和柱性能（与塔板数有关），也能检测柱的寿命（如果以相同的间隔时间重复检测），并评估柱填充物批与批之间的差异。

用于检测柱性能的肤的标准品，如Mant和Hodges(1991b)所述。

4.测量HPLC系统的梯度延迟（滞留体积）（可用另一种方法来完成此目的，见第7章）。下列几步实验必须在色谱柱与HPLC仪器未连接的状态下进行。

（1）用unionpiece(相当于零长度[zero-length]柱）将加样器直接与检测器相连。

（2）分别配制200ml洗脱液A和洗脱液B。

洗脱液A:乙腈；

洗脱液B:乙腈，0.2%丙酮

（3）以流速20ml/min，洗脱液B梯度洗10min,在254nm处检测。

加样技术将影响滞留体积的测量结果。如果加样后阀值仍维持在注人样品时的位置，则滞留体积将包括进样环的体积；如果阀被拨到上样的位置，则滞留体积就不再包括进样环的体积。若进样环>100沁，就会产生错误。如果进行分析性分离（如样品环为50W)和半制备性分离（如进样环>500ul)的进样环被弄混了，也会造成这种后果。

（4）测定梯度延迟时间，将结果绘制成类似于图5.18所示。

滞留体积即VD，是从泵的头部到层析柱人口处之间的洗脱体积（包括混合室体积）。滞留体积的大小（为2~7ml)不等。自动进样器对滞留体积有很大影响，应该补偿±0.5ml的校正值。得到的曲线图可用于分析评价梯度延迟时间，因为泵传送体积的精确度也是严格控制的。

了解梯度延迟时间对于实验方法的建立是十分必要的，因为这是精确计算S和b值（loc.cit)的基础。当建立分步梯度（此时会出现很多错误）或者将一台仪器上的HPLC系统转移到其他机器上时，梯度延迟时间的测定显得尤为重要。

四、进行蛋白质样品的分析性RP-HPLC

1.在分析样品之前，在同样条件下至少做一组空白对照。

2.用两个因子3不同的分析性RP-HPLC过程来分离肽和蛋白质样品（约100ug)。

五、梯度条件的优化

1.起始实验

在起始实验中，将肽或蛋白质样品在两个不同的线性梯度条件下分离，两个条件的不同之处在于其梯度洗脱时间把的因子3有所不同（其他所有的色谱参数均相同）(Dolan,etal，1989;Boysen，etal,1998)，这样就能够获得每个肽或蛋白质的RP-HPLC滞留时间。先不考虑最佳策略，建议最好用至少两种不同的梯度洗脱时间以鉴定重叠峰。为了优化梯度模式以获得邻近峰之间的最大分辨率，则有必要提高多肽或蛋白质的滞留时间的准确度，并将反映流动相组分分布和柱直径的参数进行分类(见表5.9)(GhristandSnyder,1988a，1988b;Ghrist，etal,1988)。尽管确定Vmix非常有用（Stadalius，etal，1984)，但还是有必要确定死体积和梯度延迟时间(Sryder，1980;Boysen，etal，1998)。

2.起始条件的选择

3.从起始色谱图中计算Inko和S值

4.峰的示踪和鉴别

5.在整个梯度范围内优化梯度时间tG

6.新的梯度范围的确定

7.新的梯度滞留时间的计算

在已知S和Inko知值的基础上，可以算出新的梯度滞留时间。

8.梯度范围的变换（可选）

在测量梯度延迟时间时，应只进行多步梯度。此时，每一梯度的起始和结尾处的梯度延迟时间将会重复出现误差。而且，在DryLabG/plus模拟实验中（依Ghrist所列出的程序而定；Ghfist，etal，1988)，用于调节梯度起始和结束处（梯度范围的边缘）梯度组成的Vmix，其产生的影响能够使实验中测定的滞留时间偏离预期的理想滞留时间。

9.结果的验证

优化程序完成后，可用预期的色谱条件来模拟验证色谱的分离效果。