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方案 21.4 用 Bradford方法测定蛋白质含量实验

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实验方法原理	溶解蛋白质，与染料混匀，l0min后阅读O.D.。
实验步骤	材料十二烷基硫酸钠（SLS,SDS)，水溶3.5mmol/L或0.3mol/LNaOH。考马斯亮蓝G-250,0.12mmol/L(0.01%)，溶于4.7%乙醇和85%(W/V)磷酸：将100mg考马斯蓝溶于50ml95%乙醇，加人100ml85%磷酸；然后以1L水稀释。蛋白质标准溶液（如BSAlOpg/ml)；设计实验，然后间隔1～2个月，以BSA或相似的标准蛋白质（150ug/ml)制作标准曲线。操作步骤 1.将蛋內质（1～20ug）或细胞（约1X10⁶)溶于100ul3.5mmol/LSLS或0.3mol/LNaOH中。 2.分别加人100ul试剂空白对照（SLS)，100ul受测蛋白质溶液，lOOulBSA标准品，每个3管。 3.加人lml考马斯蓝。混匀溶液，静置10min。 4.在分光光度计595nm处，以试剂空白作对照，阅读受测管如BSA标准数字。提示Bradford法的试剂可以从Bio-Rad购得试剂盒。试剂盒中的磺基罗丹明（SulforhodamineB)[Skehanetal，1990]和试剂N-二（羟乙基）甘氨酸(BCA)[Smithetal.，1985]都可用于测定蛋白质的含量并且对微量滴定实验敏感度很高。Micro-BCA试剂盒可从Piece(见附录ID)得到。这些试剂很灵敏，适用于少量细胞（约1X10³)的检测。

实验方法原理

溶解蛋白质，与染料混匀，l0min后阅读O.D.。

实验步骤

材料

十二烷基硫酸钠（SLS,SDS)，水溶3.5mmol/L或0.3mol/LNaOH。考马斯亮蓝G-250,0.12mmol/L(0.01%)，溶于4.7%乙醇和85%(W/V)磷酸：将100mg考马斯蓝溶于50ml95%乙醇，加人100ml85%磷酸；然后以1L水稀释。

蛋白质标准溶液（如BSAlOpg/ml)；设计实验，然后间隔1～2个月，以BSA或相似的标准蛋白质（150ug/ml)制作标准曲线。

操作步骤

1.将蛋內质（1～20ug）或细胞（约1X10⁶)溶于100ul3.5mmol/LSLS或0.3mol/LNaOH中。

2.分别加人100ul试剂空白对照（SLS)，100ul受测蛋白质溶液，lOOulBSA标准品，每个3管。

3.加人lml考马斯蓝。混匀溶液，静置10min。

4.在分光光度计595nm处，以试剂空白作对照，阅读受测管如BSA标准数字。

提示Bradford法的试剂可以从Bio-Rad购得试剂盒。试剂盒中的磺基罗丹明（SulforhodamineB)[Skehanetal，1990]和试剂N-二（羟乙基）甘氨酸(BCA)[Smithetal.，1985]都可用于测定蛋白质的含量并且对微量滴定实验敏感度很高。Micro-BCA试剂盒可从Piece(见附录ID)得到。这些试剂很灵敏，适用于少量细胞（约1X10³)的检测。