分离微管和微管相关蛋白实验一通过ATP释放法从用紫杉醇稳定的微管中分离基于微管的运动蛋白
| 实验材料 | 脑组织 试剂、试剂盒 | PME缓冲液 仪器、耗材 | 匀浆器 实验步骤 | 一、分离驱动蛋白 1.以每克组织1.5mlPME缓冲液的比例进行组织匀浆，匀浆物在39000g离心30分钟。 PME缓冲液： 0.1mol/LPIPES，pH6.9 2mmol/LEGTA 1mmol/LMgSO4 1mmol/LDTT(或DTE) 0.1mmol/LGTP 2.转移上清并在100000g离心1小时。 3.转移上清，加紫杉醇至20μmol/L，根据所研究组织的特征上升到一定温度培养15~30分钟。 4.39000g离心30分钟收集微管。 5.转移上清，加入三磷酸腺苷双磷酸酶使浓度为2单位/ml，在25℃孵育30分钟。 6.从冰箱拿出一份不含微管相关蛋白的紫杉醇稳定的微管，加到二磷酸腺苷双磷酸酶处理的上清中，使终浓度为0.1mg/ml。所加微管可以是通过用盐抽提紫杉醇稳定的微管或通过紫杉醇诱导用磷酸纤维素纯化的微管蛋白二聚体进行组装时制备的。 7.加5"-腺苷酰亚氨基二磷酸（AMP-PNP)使浓度为0.5mmol/L。根据所研究组织的特征，上升到一定温度培养30分钟。 8.以39000g离心30分钟沉淀微管和与其结合的驱动蛋白。 9.去上清，用含0.1mmol/LAMP-PNP和20μmol/L紫杉醇的PME缓冲液重悬沉淀物。 10.以39000g离心30分钟收集微管和与其结合的驱动蛋白。 11.去掉上清。用少量含20μmol/L紫杉醇和10mmol/LMg-ATP的PME重悬沉淀物。根据所研究组织的特性，上升到一定温度培养30分钟。在温育期间，不经常地用巴斯德吸管上下吸溶液来轻轻搅拌。 12.如步骤10离心，分离这时已经从微管释放出来的驱动蛋白。 二、分离细胞质动力蛋白 1.以每克组织1.5mlPME缓冲液的比例进行组织匀浆，匀浆物在39000g离心30分钟。 PME缓冲液： 0.1mol/LPIPES，pH6.9 2mmol/LEGTA 1mmol/LMgSO4 1mmol/LDTT(或DTE) 1.0mmol/LGTP 2.转移上清并在100000g离心1小时。 3.转移上清并加入二磷酸腺苷双磷酸酶使浓度为2单位/ml，在25℃温育30分钟。 4.在步骤3温育的时候，从冰箱拿出一份不含微管相关蛋白的紫杉醇稳定的微管，加到步骤3二磷酸腺苷双磷酸酶处理的上清中，使终浓度为0.1mg/ml。微管可以是通过盐抽提用紫杉醇稳定的微管或通过用紫杉醇诱导组装磷酸纤维素纯化的微管蛋白二聚体而制备的。调整紫杉醇至20μmol/L，根据所研究组织的特性，上升到一定温度培养30分钟。 5.以39000g离心30分钟收集微管和与其结合的动力蛋白。 6.去掉上清，用含20μmol/L紫杉醇的PME重悬沉淀物，并如步骤5收集微管。 7.去掉上清。用少量含20μmol/L紫杉醇和10mmol/LMg-ATP的PME重悬沉淀物并根据所研究组织的特性，上升到一定温度培养30分钟。在温育期间，不经常地通过巴斯德吸管上下吸溶液来轻轻搅拌。 8.如步骤5离心，分离这时已经从微管中释放出来的动力蛋白。 三、通过蔗糖梯度离心分离驱动蛋白和动力蛋白 1.用含0.1mmol/LGTP和1mmol/LATP的PME缓冲液准备5%~20%的蔗糖梯度。 PME缓冲液： 0.1mol/LPIPES，pH6.9 2mmol/LEGTA 1mmol/LMgSO4 1mmol/LDTT(或DTE) 0.1mmol/LGTP 1mmol/LATP 2.把含ATP释放的驱动蛋白和/或细胞质动力蛋白的样品（总体积最多不超过1ml）加样到梯度上。 3.样品用BeckmanSW41转头在4℃以31500r/min离心16小时。 4.收集梯度溶液，每管0.5ml。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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