离子交换法制备肝素实验一离子交换法
| 实验方法原理 | 测定肝素的方法主要有生物测定法、紫外分光光度法、化学法。肝素分子具有强负电性，能与带正电荷的分子结合生成复合物。天青A是一种碱性染料，和肝素生成的复合物表现出“光异色现象”，即改变染料原有的吸收光谱。控制染料浓度，在pH8.6介质中肝素浓度低时，505nm的光吸收与肝素浓度的关系符合朗-比尔定律。 | ||||||
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| 实验材料 | 肠粘膜或猪肝 试剂、试剂盒 | 巴比妥缓冲液阿拉伯胶天青A肝素 仪器、耗材 | 烧杯试管试管架玻棒磁力搅拌器电炉吸滤瓶布氏漏斗离心机722分光光度计容量瓶真空干燥器真空泵水浴锅滤纸布袋。精密pH试纸
实验步骤 | 溶液配制： 1.巴比妥缓冲液(pH8.6，0.05mol/L)：称取1g氢氧化钠溶于50ml沸水 ，再精确称取二己基巴比妥酸5052 g溶于上述溶液中，冷却后稀释至500ml，pH计校正到pH8.6。 2.0.1%阿拉伯胶溶液：称取0.5g，先用少量水分散，再稀释至500ml，过滤备用。 3.0.1%天青A溶液(称取0.5g，先用少量水在研钵中研磨溶解，再稀释至500ml，过滤，冰箱储备。用时再稀释5倍。 4.肝素标准溶液：准确称取一定量的肝素标准品，用灭菌水配成100U/ml的标准溶液，冰箱暂放 ，用时以水稀释100倍。 操作步骤： 1.提取（盐解法） 新鲜猪肠粘膜2kg（或猪肝捣碎），加入氯化钠80g（4%浓度），搅拌溶解后用40%氢氧化钠溶液调pH至9.0（用广泛pH试纸），水浴加热至50～55℃搅拌提取2h，然后升温至90℃保持10min，冷却至60℃用布袋过滤，取滤液待离子交换用。 2.离子交换 将滤液用水稀释3倍，加入D254树脂（氯型）120g（按投料量6%，W/W），慢速搅拌6h（可每隔1h抽样测定提取液中剩余肝素的含量），过滤取树脂。 3.洗涤、洗脱 取离子交换后的树脂先用自来水洗净，而后用蒸馏水洗净。取洗净树脂加入等体积1.4mol/L氯化钠溶液慢速搅拌1h，过滤取树脂。继续用0.5倍体积的5mol/L氯化钠溶液慢速搅拌2h，过滤收集滤液（取样测含量）。树脂再加入0.5倍体积的3 mol/L氯化钠溶液，慢速搅拌1h，过滤，滤液收集（取样测含量）。树脂再用0.5倍3mol/L氯化钠溶液慢速搅拌2h，过滤，滤液收集（取样测含量），合并三次洗脱滤液。 4.粗制肝素 取合并滤液加入1.5～2倍体积的95%乙醇洗一次，丙酮洗两次，真空干燥即得粗品肝素。 5.精制肝素 称取粗制肝素粉末用1%氯化钠溶液（预冷却）适量溶解，调pH1.8左右，离心15 min，上清液经砂心漏斗去除离心液表面的脂肪。悬液在水浴上加热至80～90℃，滴加0.0003mol/L高锰酸钾溶液（按0.1～0.2mol/亿单位），用滤纸法检测终点，滤液加入30%过氧化氢，调pH至11，放置36h（冰箱内）。抽滤，滤液调pH至6.4，加入1倍体积的95%乙醇，离心，沉淀用95%乙醇洗二次，丙酮洗两次，真空干燥即得精制肝素。 6.天青法测定效价 （1）标准曲线的制作:取较大试管（易混匀）6支，以0～5编号，按下表操作。加入阿拉伯胶后必须摇匀方可加入染料，混匀后用722型分光光度计测505nm处吸收值，以吸收值为纵坐标，单位数为横坐标绘制标准曲线。 （2）样品测定:精确称取样品约10mg，先配成1mg/ml溶液，再以2个100ml容量瓶稀释为1mg/100ml溶液、2 mg/100ml测定液，按下表操作并记录吸收值，分别从标准曲线上查出相应单位数，按下式计算样品效价，取平均值。   单位为U/mg，式中Pi为由A值在标准曲线上查出的单位数；V为测定样品的总毫升数；Vi为测定所用样品的毫升数；Sw为称取样品的毫克数。 免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
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发布于 ： 2018-08-06
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