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比较分子生理基因组学—cDNA阵列的异种杂交实验资讯分析测试...

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实验步骤	一、材料这里用到的所有化学试剂都为分子生物学等级，或者用它们最高纯度的等效物。所有的塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸头都要高压灭菌，在核酸实验操作过程中必须始终戴手套。CDNAATLAS阵列从Clontech购得。人19KcDNA阵列从Ontario癌症研究所购得。 1总RNA的提取（1）焦碳酸二乙酯（DEPC)(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO)加人水中，终浓度为0.1%搅拌过夜（>12h)，高压灭菌。吸头、管子和其他塑料或玻璃制品可以购买无RNase的或者在DEPC水中搅拌过夜，去除RNase。这部分实验所有的溶液制备和RNA样本溶解都需要使用DEPC水和无RNase的塑料或玻璃制品。（2）TRIzol溶液（Invitrogen，Carlsbad，CA)。（3）氯仿（FisherScientific,Fairlawn，NJ)。（4）异丙醇（FisherScientific)。（5）70%乙醇。于70mL无水乙醇（Pharmco，Brookfield,CT)中加人30mLDEPC水。 2RNA变性凝胶电泳 3mRNA提取（1）Oligotexpoly(A)+mRNA提取试剂盒（Qiagen)。注意：下面列出的3种缓冲液是试剂盒配套试剂。, （2）Oligotex结合缓冲液（OBB):20mmol/LTris-HCl，pH7.5，lmol/LNaCl,2mmol/LEDTA,0.2%(WV)十二烷基磺酸钠（SDS;Sigma-Aldrich)。（3）Oligotex清洗缓冲液（OWB):10mmol,/LTris-HCl,pH7.5，150mmol/LNaCl，Immol/LEDTA。（4）Oligotex洗脱缓冲液（OEB):5mmol/LTris-HCl，pH7.5。 4cDNA探针合成（1）1μgmRNA样本。（2）聚合酶链反应（PCR)仪[例如Bio——RadiCycler(Bio-Rad)，PTC-100(MJResearch)] 5DNA阵列杂交和清洗（1）Church缓冲液：0.25mol/LNa₂HPO₄,0.25mol/LNaH₂PO₄,pH7.5，7%SDS(W/V) （2）20XSSC:3.0mol/LNaCl，0•3mol/L梓釋酸钠（Sigma-Aldrich)。（3）20%SDS(W/V) （4）酵母tRNA(10mg/mL)(Invitrogen)。（5）小牛胸腺DNA(10mg/mL)(Sigma)。（6）DIGEasyHybe溶液（Roche)。 6DNA阵列分析（1）X光底片或磷屏成像系统（用于ATLAS^TMcDNA阵列）。（2）微阵列分析仪（分析人的19KcDNA阵列）。有很多公司(AlphaInn〇tech、Affymetrix、VersArrayChipReader)销售阵列分析仪，但有些公司或服务机构(还有很多研究所的设备中心）能够提供收费的阵列扫描和分析服务，这样比购买一台分析仪要经济得多。 3.可以下载的分析软件（例如Scanalyze;http://rana.lbl.gov)。 7结果验证：半定量反转录酶_聚合酶链反应（RT-PCR) （1）DNAman软件（LynnonBiosoft)。（2）引物设计软件（ScientificandEducationalSoftware)。（3）BicrRADICycler(Bio^Rad)或其他梯度PCR仪。（4）50XTAE缓冲液：242gTris碱，pH8.5,57.ImL冰乙酸，37.2gEDTA，IL双蒸水。（5）1%TAE琼脂糖凝胶：IXTAE缓冲液，1%琼脂糖（W/V）,溴化乙锭（1μg/mL)加入到100mL水中。（6）DNA上样染料：0.25%(W/V）溴酚蓝，0.25%(W/V)二甲苯青，50%(W/V)甘油。（7）DNA分子质量标准（Invitrogen)。根据预期的PCR产物大小选择合适的分子质量标准（从100bp到几kb不等)。二、方法在开始任何微阵列实验之前，必须要选定合适的对照和时间点，这样获得的数据才有生物学意义。关于如何选择合适的对照，参见注释1和2。 1总RNA的提取 2RNA变性凝胶电泳（1）制备一块1%的琼脂糖甲醛变性胶，浸没在IXMOPS缓冲液中，胶上的孔应被溶液完全没过。将胶预电泳15min(与此同时准备RNA样品）。（2）取适当体积的总RNA(含有10〜20μgRNA)，加人到置于冰上的标记管中，用DEPC水调整总体积到15μL。向每管中加入15μLRNA样品缓冲液和6μL6XRNA上样缓冲液。（3）将样品于55°C孵育10min,迅速置于冰上。向每管中加入适当体积的RNA上样缓冲液，使每个样品中的上样缓冲液达到IX的终浓度。（4）将RNA样品轻轻混匀，短暂离心，将所有的样品都收于Eppendorf管的底部。（5）将每个管中所有的样品都加到胶孔中，记录加样顺序。（6）于100V进行电泳，当指示染料的前端到达胶底部时结束电泳。胶置于塑料膜上，于紫外灯下观察电泳结果。28S和18S核糖体RNA(rRNA)条带作为RNA质量的判断标准，两者比例应该约为2:1。这一步保证了DNA阵列杂交用mRNA提取之前的总RNA的质量。虽然总RNA也可用来进行探针合成，但是我们推荐使用mRNA。当28SrRNA与18SrRNA条带的比例远不足2:1或样品条带出现弥散时，可认为RNA的质量比较差（关于微阵列分析所用RNA的最大量见注释3)。 3用OligotexminiKit(Qiagen)进行mRNA提取 4cDNA探针合成（1）PCR仪预热到70°C，向每个0.5mL的PCR管（或0•2mL的管子，取决于PCR仪加热模块上孔的大小）中加入Iμg(至少0.5(ug/μL)的各个mRNA样品（对照或实验组）。向每管中加人100ng01igo-5’-dT₂₀N-3’和100ng随机引物（共200ng)，确保整个mRNA库的完全标记。干后，各自溶解于5/μL水或TE(10mmol/LTris减，pH8.0，Immol/LEDTA)缓冲液中，这两个样品在与阵列杂交前混合成一个cDNA库。 5DNA阵列杂交和清洗 5.1ClontechATLAS™阵列的杂交和清洗（见注释6) （1）阵列的同源杂交建议杂交温度为68°C，但是我们发现异源杂交温度必须要低一些。对哺乳类冬眠动物来说，68°C杂交也能产生信号但是55°C杂交效果会更好。我们最终发现44°C在Church’s缓冲液中杂交过夜结果最好。与非哺乳类物种进行异源杂交时，将温度降低到40°C会产生最好的杂交信号，背景也极低。（2）杂交结束后，需要通过调整和监测清洗步骤保证异源杂交系统中没有杂交信号损失。清洗开始用5XSSC(用20X的储液稀释），1%SDS,然后用2XSSC,1%SDS,再用1XSSC,0.5%SDS，最后用0•5XSSC，0•5%SDS。每一步清洗完后，ATLAS™阵列都需要用盖革计数器检测杂交信号强度。如果发现信号降到500〜1000cpm，应立即停止清洗，将ATLAS™阵列用X光片或射线显影板曝光。当底片显影或显影板扫描读取后，可将两张底片或两张图像（对照和实验组）叠放，首先进行目测筛选差异表达基因。如果要得到更加量化的结果，将来自显影板或X光片的每张图像转化成软件可以分析的.tiff文件。（3）ATLAS™阵列至少可以重复使用3次。阵列在10%SDS中煮10min进行洗脱，然后用2XSSC去除SDS。将阵列用玻璃纸包裹后保存于-20°C至再次使用。 5.2人19K微阵列的杂交和清洗（采用Ontario癌症研究所的实验方法，www.microarray,ca/,见注释6) （1）制备杂交液。每个杂交反应取100μLDIGEasyHyb溶液，加入5μL酵母tRNA(10mg/mL)(Invitrogen)和5μL小牛胸腺DNA(10mg/mL)(Sgma)减少非特异结合。混合物于65°C加热2min，冷却到室温。（2）向Cy3-Cy5标记的cDNA样品中加入80μL制备好的杂交液，混合物再置于65°C加热2min，冷却到室温。（3）使用19K人源微阵列时，由于基因点在两块玻片上，所以向玻片上加入制备好的探针时应非常小心。将一张玻片放在另一张上，两张玻片都将点有阵列的一面向内。小心将含有探针混合物的杂交液缓慢均匀地沿着其中的一边加入以防止产生气泡。（4）将剩余的杂交液置于一杂交盒（水平放置于37°C恒温箱中的可密封的玻片盒）中用来保证杂交反应体系的湿度。将玻片置于杂交盒中37°C孵育过夜。不需要调整杂交温度。（5）杂交结束后，用2XSSC洗去玻片上的杂交液，将微阵列玻片置于一个玻片架上进行进一步清洗，先用预热的（50℃）2XSCC，0.1%SDS洗10min，再用预热的（50°C)1XSSC，0.1%SDS洗10min。最后，将玻片浸人IXSSC中，然后用异丙醇短暂清洗，500g离心去掉未结合的荧光cDNA。微阵列可以用两个波长扫描，对不同的荧光定量。生成两个图像文件后进行荧光强度分析。如果担心由于进化上较大的差异不能产生好的杂交信号，建议清洗时降低严谨度。例如当研究中使用的cDNA同源性只有60%〜80%时，建议将清洗温度降低到45°C,而且只进行2XSSC这一步清洗。根据我们和其他实验室的经验（40)，洗液中的盐浓度对于去除阵列上结合的探针最为关键。 6DNA阵列分析 cDNA阵列的分析近年来已经变得越来越简单。我们的分析主要是用MichaelEisen开发的Scanalyze程序完成的，这个程（http://rana.lbl.gov/)是免费的，可以与阵列上目标基因的目测筛选搭配使用。Scanalyze允许用户一次输入两个阵列图像，一般来说一张为Cy3杂交生成的扫描图像，另一张为Cy5生成的图像。可以从http://rana.lbl.gov/manuals/ScanAlyzeDoc.pdf获得进一步的信息。还有很多其他的DNA阵列分析软件，相关内容见注释7。（1）将19KcDNA阵列Cy3和Cy5扫描保存的.tiff文件分别在Channel1和Channel2中打开。（2）图像载人后，点击「redraw」调整每张图像的增益和均一化使它们具有相同的亮度和强度。（3）对图像挪格化将每个19KcDNA「点」都用一个Scanalyze生成的圆圈框起来。对每一批新导入的阵列图像都要先创建新的栅格。在GridControl面板上点击「NewGrid」，选取1〜32个格子。（4）输人每个格子的行数和列数、行宽和列宽，以及行高和列高。（5）由于阵列点印有时做不到很理想，格子可能与阵列不太匹配。如果出现这样的情况，可以用Scanalyze的方向按钮（directional)将格子进行上下左右移动和拉伸。当阵列的格子调整到差不多在每张图像上能够重合时，按「refine」,Scanalyze会将格子调整到最合适的大小。如果选定的点出现错配，可以通过「spot」选项和方向按钮的操作对这些点进行单独匹配。（6）当格子调整到适合阵列后，点击数据保存按钮（savedata)。Scanalyze会对阵列上每个点的输出信息进行计算，结果以tab分页格式导出，可在MicrosoftExcel中打开。（7）目前为止最快速、最简便的分析方法仍是测定ChannelI:Channel2生成的杂交信号强度的比值（例如对照组与冬眠组）。通过这种分析可以得到两种状态下基因水平比较的一个概况。由于数据导出到MicrosoftExcel中，可以对比值从高到低（或从低到高）进行排序（点击「Data」，然后选择「Sort」）。显示出阵列中上调或下调最明显的点，鉴定其对应基因后，进行后续分析（见注释8)。 7结果验证：半定量PCR(见注解9) （1）对每个筛选出来的目标基因，从NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)下载其他动物中的同源基因序列。（2）从下拉菜单中选择「nucleotide」，输人目标基因的名字或缩写。（3）得到一个基因的序列后，可以很简单地利用Blast数据库（www.ncbi.nlmnih.gov/BLAST/)搜索获取其他物种同源基因。下载目标基因在多个物种中的同源序列。例如研究松鼠基因时，可以选择其他啮齿类和（或）哺乳动物（例如小鼠、大鼠和人)‘的序列。例如对于冬眠动物的基因，我们一般用人（Homo小家鼠（MmswzmscmZms)和褐家鼠（兄确定同源区域。对进化距离更远的动物来说，选择更具多样性的基因和（或）来自与目标物种系统发育上更接近物种的基因会更加有效。例如分析一个海龟的基因时，选择蛙类、鸡和大鼠的序列进行初始分析会更合适。一般选择3个同源序列就足够，但是要对一个基因进行更深人的研究，可以选择多个序列进行分析。 8展望一微阵列数据的可比性，比较基因组学和冬眠对于DNA阵列分析，早期人们比较担心的是缺少能够收纳研究产生的大量信息的公共领域（48-50)。解决方法是创建特别的公共数据库，研究者可以通过这种数据库的免费使用接触到大量微阵列数据，从而促进一些看上去不相关的领域的快速发展。举例来说，一个研究者在研究某一特定基因时，可以通过查询各种各样的微阵列数据来确定这个基因的时空表达情况，从而提出与其他基因相关的基因调控的假设。这正是NIH引入的基因表达数据库（GEO)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的目的（51，52)。同时还有其他的微阵列数据库，比如Standford大学微阵列数据库[StandfordUniversityMicroarrayDatabase(http：/7genome-www5.Stanford,edu/)],列出了公共数据、参考文献和数据来源的物种；欧洲生物信息学研究院（EuropeanBioinformaticsInstitute)的ArrayExpress数据库（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)(53-56)，功能与NIHGEO数据库相似，包括覆盖了至少35个物种的超过12000个杂交的数据。目前为止，GEO是最大最全的开放数据库，提供科学家免费查询获得的高通量数据，这些数据涉及mRNA表达、基因组DNA分析、基因表达系列分析（SAGE)、质谱和蛋白质组学等方面。虽然这些数据库非常有用，特别是对于模式生物的研究者，但是它们最近才开始被从事比较学研究的人所使用。很明显通过跨物种的异源微阵列分析，比较研究学家能够极大地提高他们的研究产出。下列两种情况不能采用跨物种的异源阵列筛选方法：（1)阵列和目标物种基因之间的同源性太低；（2)对某一特定物种特异的新发现的基因，从而在商品化的阵列上没有对应同源物。但越来越多的新物种阵列正在不停地产生，所以某种程度上来说，当与目标物种系统发育上接近的物种有可用的阵列时，上述两个问题都能被克服。例如在冬眠研究领域，MattAndrews实验室（57)最•近用来自于墨西哥黄鼠(S.irzWecemGweatos)cDNA文库中的4000多个cDNA制备了一’个DNA阵列，并用这个阵列进行冬眠期间心脏内转录组的分析。由于阵列上只点了4000个基因，基因组的很大一部分未列在其中，因此目前来说，异源杂交得到的结果更具有广泛性，比如我们地松鼠的cDNA和商品化的人19OOO个基因的阵列杂交，杂交度达到85%〜90%。但是，用物种特异的阵列有机会发现只存在于冬眠动物中的新基因（即人类的基因组中没有的基因），因此物种特异的阵列在冬眠表型的遗传分析中有着不可取代的作用。由于不管使用何种阵列平台，阵列筛选之后必然进行的是严格的后续分析，所以这对使用异源cDNA阵列杂交的比较生物学家来说是一个优势，特别是在目标物种与模式物种有较高同源性的情况下。由于全世界的生物学工作者都在对非传统模式物种的基因组进行测序，包括人类基因组计划指定要进行全基因组测序的墨西哥黄鼠，异源微阵列分析领域在未来几年中必将有很大的发展。对多物种的基因和基因结构的注释和分析将为精确的基因鉴定和同源性分析提供可能，并且进一步确认异源微阵列对未来比较生物学家的跨物种工作的重要价值。展开
注意事项	（1）任何阵列研究很重要的部分是确定实验路线和合适的对照。在所有的科学工作中，选择合适的对照条件是恰当诠释处理条件下基因表达变化的关键因素。这点在阵列筛选研究中看上去尤其重要，因为这种研究进行的是mRNA的分析，而mRNA在细胞中半衰期极短，所以对阵列研究来说最好能选择在时间和处理前状态上尽可能相似的对照和实验组样品，目前冬眠研究领域的一个现有的争论提供了很好的例子。我们想要了解蛰伏的调控机制以及什么基因的表达需要被上调从而帮助动物进人蛰伏状态和（或）稳定代谢，活过这个很长的蛰伏期^因此我们选择了尽可能相似的对照和实验组动物：在这个实验中，对照组是体温37°C的动物，它们在一个5°C的房间里但还没进人冬眠，而实验组动物是在同一个房间内已进入蛰伏期的动物，它们的体温已接近室温。这样我们就可以得到活跃状态和蛰伏状态基因表达的差异。与此相反，一些其他的研究小组提倡用夏季活跃的动物与冬天进入费伏期的动物进行比较（58)。这样做可以体现器官中mRNA的季节差异但对于冬眠调控的研究来说是不合适的，因为夏季和冬季的动物存在太多差异，包括环境条件（例如光周期和温周期）、生理状态(例如进食活跃与否，•夏季动物地上频繁活动对比冬季蛰伏动物在洞穴中进行睡眠），以及生殖状态。这种差异使得我们不可能「切割，，出蛰伏特异的基因表达变化来单独研究。因此夏季活跃的动物可以说是一个极为糟糕的生物学对照，更可以说是一个错误的时间点，对冬眠的整体研究是一个毁灭性的因素。事实上，应用我们的实验体系（恒温的相对于蛰伏的动物）进行基因筛选，结果显示当动物进人蜜伏期后有大量基因的表达被特异性地诱导；这些基因看上去在蛰伏状态下发挥着不可或缺的生物学功能。相对于恒温的对照组，我们也在蛰伏实验组中发现了应激诱导的信号转导途径发生了广泛的器官特异性的激活，其中包括了丝裂原激活蛋白激酶（17,59)，说明蛰伏期间体内器官还是维持了基本的代谢活性。这些发现实际上与一些之前冬眠研究中所谓的「常规的经验」相反，它们认为蛰伏期间大多数的生物进程都减弱或干脆停止。（2）值得注意的是我们用KinexusKinetworks™磷酸化蛋白（表2)进行的应激标记物筛选，结果显示了选定的蛋白质在冬眠期的墨西哥黄鼠肝脏中磷酸化状态有所改变，对冬眠动物在蛰伏期体内确实维持了一定的代谢活性这个概念是一个有力的支持。结果显示p38(Thr18°/Tyr182)磷酸化状态没有改变，JUN(Ser73)磷酸化程度的提高，AKT在Ser473而不是Thr3。8位置上磷酸化程度的降低。我们的数据与之前对贝氏黄鼠（S.Hckr心和墨西哥黄鼠的研究结果一致：蛰伏期间，P38活性不发生变化，而磷酸化JUN的上游激酶JNK的活性则被大幅度提高（59);而之前对墨西哥黄鼠的研究也显示在蛰伏和冬眠期间AKT在Ser473而不是Thria8位置上磷酸化程度的降低（60）。因此阵列筛选的数据与很多传统实验体系得到的数据是相吻合的。（3）微阵列分析所用的cDNA探针要进行荧光或放射标记。荧光探针专用于高密度的DNA微阵列,32P标记的探针一般用于宏阵列，像ClontechATLAS™阵列。异源杂交实验中，根据我们的经验当满足以下几个条件时，实验会很成功： a.两个物种间基因的同源性较高（检测物种相对于制备阵列的物种）。 b.最适量的初始材料。 C.比同源杂交实验的严谨度稍低的杂交条件。展开

实验步骤

一、材料

这里用到的所有化学试剂都为分子生物学等级，或者用它们最高纯度的等效物。所有的塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸头都要高压灭菌，在核酸实验操作过程中必须始终戴手套。CDNAATLAS阵列从Clontech购得。人19KcDNA阵列从Ontario癌症研究所购得。

1总RNA的提取

（1）焦碳酸二乙酯（DEPC)(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO)加人水中，终浓度为0.1%搅拌过夜（>12h)，高压灭菌。吸头、管子和其他塑料或玻璃
制品可以购买无RNase的或者在DEPC水中搅拌过夜，去除RNase。这部分实验所有的溶液制备和RNA样本溶解都需要使用DEPC水和无RNase的塑料或玻璃制品。

（2）TRIzol溶液（Invitrogen，Carlsbad，CA)。

（3）氯仿（FisherScientific,Fairlawn，NJ)。

（4）异丙醇（FisherScientific)。

（5）70%乙醇。于70mL无水乙醇（Pharmco，Brookfield,CT)中加人30mLDEPC水。

2RNA变性凝胶电泳

3mRNA提取

（1）Oligotexpoly(A)+mRNA提取试剂盒（Qiagen)。注意：下面列出的3种缓冲液是试剂盒配套试剂。,

（2）Oligotex结合缓冲液（OBB):20mmol/LTris-HCl，pH7.5，lmol/LNaCl,2mmol/LEDTA,0.2%(WV)十二烷基磺酸钠（SDS;Sigma-Aldrich)。

（3）Oligotex清洗缓冲液（OWB):10mmol,/LTris-HCl,pH7.5，150mmol/LNaCl，Immol/LEDTA。

（4）Oligotex洗脱缓冲液（OEB):5mmol/LTris-HCl，pH7.5。

4cDNA探针合成

（1）1μgmRNA样本。

（2）聚合酶链反应（PCR)仪[例如Bio——RadiCycler(Bio-Rad)，PTC-100(MJResearch)]

5DNA阵列杂交和清洗

（1）Church缓冲液：0.25mol/LNa₂HPO₄,0.25mol/LNaH₂PO₄,pH7.5，7%SDS(W/V)

（2）20XSSC:3.0mol/LNaCl，0•3mol/L梓釋酸钠（Sigma-Aldrich)。

（3）20%SDS(W/V)

（4）酵母tRNA(10mg/mL)(Invitrogen)。

（5）小牛胸腺DNA(10mg/mL)(Sigma)。

（6）DIGEasyHybe溶液（Roche)。

6DNA阵列分析

（1）X光底片或磷屏成像系统（用于ATLAS^TMcDNA阵列）。

（2）微阵列分析仪（分析人的19KcDNA阵列）。有很多公司(AlphaInn〇tech、Affymetrix、VersArrayChipReader)销售阵列分析仪，但有些公司或服务机构(还有很多研究所的设备中心）能够提供收费的阵列扫描和分析服务，这样比购买一台分析仪要经济得多。

3.可以下载的分析软件（例如Scanalyze;http://rana.lbl.gov)。

7结果验证：半定量反转录酶_聚合酶链反应（RT-PCR)

（1）DNAman软件（LynnonBiosoft)。

（2）引物设计软件（ScientificandEducationalSoftware)。

（3）BicrRADICycler(Bio^Rad)或其他梯度PCR仪。

（4）50XTAE缓冲液：242gTris碱，pH8.5,57.ImL冰乙酸，37.2gEDTA，IL双蒸水。

（5）1%TAE琼脂糖凝胶：IXTAE缓冲液，1%琼脂糖（W/V）,溴化乙锭（1μg/mL)加入到100mL水中。

（6）DNA上样染料：0.25%(W/V）溴酚蓝，0.25%(W/V)二甲苯青，50%(W/V)甘油。

（7）DNA分子质量标准（Invitrogen)。根据预期的PCR产物大小选择合适的分子质量标准（从100bp到几kb不等)。

二、方法

在开始任何微阵列实验之前，必须要选定合适的对照和时间点，这样获得的数据才有生物学意义。关于如何选择合适的对照，参见注释1和2。

1总RNA的提取

2RNA变性凝胶电泳

（1）制备一块1%的琼脂糖甲醛变性胶，浸没在IXMOPS缓冲液中，胶上的孔应被溶液完全没过。将胶预电泳15min(与此同时准备RNA样品）。

（2）取适当体积的总RNA(含有10〜20μgRNA)，加人到置于冰上的标记管中，用DEPC水调整总体积到15μL。向每管中加入15μLRNA样品缓冲液和6μL6XRNA上样缓冲液。

（3）将样品于55°C孵育10min,迅速置于冰上。向每管中加入适当体积的RNA上样缓冲液，使每个样品中的上样缓冲液达到IX的终浓度。

（4）将RNA样品轻轻混匀，短暂离心，将所有的样品都收于Eppendorf管的底部。

（5）将每个管中所有的样品都加到胶孔中，记录加样顺序。

（6）于100V进行电泳，当指示染料的前端到达胶底部时结束电泳。胶置于塑料膜上，于紫外灯下观察电泳结果。28S和18S核糖体RNA(rRNA)条带作为RNA质量的判断标准，两者比例应该约为2:1。这一步保证了DNA阵列杂交用mRNA提取之前的总RNA的质量。虽然总RNA也可用来进行探针合成，但是我们推荐使用mRNA。当28SrRNA与18SrRNA条带的比例远不足2:1或样品条带出现弥散时，可认为RNA的质量比较差（关于微阵列分析所用RNA的最大量见注释3)。

3用OligotexminiKit(Qiagen)进行mRNA提取

4cDNA探针合成

（1）PCR仪预热到70°C，向每个0.5mL的PCR管（或0•2mL的管子，取决于PCR仪加热模块上孔的大小）中加入Iμg(至少0.5(ug/μL)的各个mRNA样品（对照或实验组）。向每管中加人100ng01igo-5’-dT₂₀N-3’和100ng随机引物（共200ng)，确保整个mRNA库的完全标记。

干后，各自溶解于5/μL水或TE(10mmol/LTris减，pH8.0，Immol/LEDTA)缓冲液中，这两个样品在与阵列杂交前混合成一个cDNA库。

5DNA阵列杂交和清洗

5.1ClontechATLAS™阵列的杂交和清洗（见注释6)

（1）阵列的同源杂交建议杂交温度为68°C，但是我们发现异源杂交温度必须要低一些。对哺乳类冬眠动物来说，68°C杂交也能产生信号但是55°C杂交效果会更好。我们最终发现44°C在Church’s缓冲液中杂交过夜结果最好。与非哺乳类物种进行异源杂交时，将温度降低到40°C会产生最好的杂交信号，背景也极低。

（2）杂交结束后，需要通过调整和监测清洗步骤保证异源杂交系统中没有杂交信号损失。清洗开始用5XSSC(用20X的储液稀释），1%SDS,然后用2XSSC,1%SDS,再用1XSSC,0.5%SDS，最后用0•5XSSC，0•5%SDS。每一步清洗完后，ATLAS™阵列都需要用盖革计数器检测杂交信号强度。如果发现信号降到500〜1000cpm，应立即停止清洗，将ATLAS™阵列用X光片或射线显影板曝光。当底片显影或显影板扫描读取后，可将两张底片或两张图像（对照和实验组）叠放，首先进行目测筛选差异表达基因。如果要得到更加量化的结果，将来自显影板或X光片的每张图像转化成软件可以分析的.tiff文件。

（3）ATLAS™阵列至少可以重复使用3次。阵列在10%SDS中煮10min进行洗脱，然后用2XSSC去除SDS。将阵列用玻璃纸包裹后保存于-20°C至再次使用。

5.2人19K微阵列的杂交和清洗（采用Ontario癌症研究所的实验方法，www.microarray,ca/,见注释6)

（1）制备杂交液。每个杂交反应取100μLDIGEasyHyb溶液，加入5μL酵母tRNA(10mg/mL)(Invitrogen)和5μL小牛胸腺DNA(10mg/mL)(Sgma)减少非特异结合。混合物于65°C加热2min，冷却到室温。

（2）向Cy3-Cy5标记的cDNA样品中加入80μL制备好的杂交液，混合物再置于65°C加热2min，冷却到室温。

（3）使用19K人源微阵列时，由于基因点在两块玻片上，所以向玻片上加入制备好的探针时应非常小心。将一张玻片放在另一张上，两张玻片都将点有阵列的一面向内。小心将含有探针混合物的杂交液缓慢均匀地沿着其中的一边加入以防止产生气泡。

（4）将剩余的杂交液置于一杂交盒（水平放置于37°C恒温箱中的可密封的玻片盒）中用来保证杂交反应体系的湿度。将玻片置于杂交盒中37°C孵育过夜。不需要调整杂交温度。

（5）杂交结束后，用2XSSC洗去玻片上的杂交液，将微阵列玻片置于一个玻片架上进行进一步清洗，先用预热的（50℃）2XSCC，0.1%SDS洗10min，再用预热的（50°C)1XSSC，0.1%SDS洗10min。最后，将玻片浸人IXSSC中，然后用异丙醇短暂清洗，500g离心去掉未结合的荧光cDNA。微阵列可以用两个波长扫描，对不同的荧光定量。生成两个图像文件后进行荧光强度分析。如果担心由于进化上较大的差异不能产生好的杂交信号，建议清洗时降低严谨度。例如当研究中使用的cDNA同源性只有60%〜80%时，建议将清洗温度降低到45°C,而且只进行2XSSC这一步清洗。根据我们和其他实验室的经验（40)，洗液中的盐浓度对于去除阵列上结合的探针最为关键。

6DNA阵列分析

cDNA阵列的分析近年来已经变得越来越简单。我们的分析主要是用MichaelEisen开发的Scanalyze程序完成的，这个程（http://rana.lbl.gov/)是免费的，可以与阵列上目标基因的目测筛选搭配使用。Scanalyze允许用户一次输入两个阵列图像，一般来说一张为Cy3杂交生成的扫描图像，另一张为Cy5生成的图像。可以从http://rana.lbl.gov/manuals/ScanAlyzeDoc.pdf获得进一步的信息。还有很多其他的DNA阵列分析软件，相关内容见注释7。

（1）将19KcDNA阵列Cy3和Cy5扫描保存的.tiff文件分别在Channel1和Channel2中打开。

（2）图像载人后，点击「redraw」调整每张图像的增益和均一化使它们具有相同的亮度和强度。

（3）对图像挪格化将每个19KcDNA「点」都用一个Scanalyze生成的圆圈框起来。对每一批新导入的阵列图像都要先创建新的栅格。在GridControl面板上点击「NewGrid」，选取1〜32个格子。

（4）输人每个格子的行数和列数、行宽和列宽，以及行高和列高。

（5）由于阵列点印有时做不到很理想，格子可能与阵列不太匹配。如果出现这样的情况，可以用Scanalyze的方向按钮（directional)将格子进行上下左右移动和拉伸。当阵列的格子调整到差不多在每张图像上能够重合时，按「refine」,Scanalyze会将格子调整到最合适的大小。如果选定的点出现错配，可以通过「spot」选项和方向按钮的操作对这些点进行单独匹配。

（6）当格子调整到适合阵列后，点击数据保存按钮（savedata)。Scanalyze会对阵列上每个点的输出信息进行计算，结果以tab分页格式导出，可在MicrosoftExcel中打开。

（7）目前为止最快速、最简便的分析方法仍是测定ChannelI:Channel2生成的杂交信号强度的比值（例如对照组与冬眠组）。通过这种分析可以得到两种状态下基因水平比较的一个概况。由于数据导出到MicrosoftExcel中，可以对比值从高到低（或从低到高）进行排序（点击「Data」，然后选择「Sort」）。显示出阵列中上调或下调最明显的点，鉴定其对应基因后，进行后续分析（见注释8)。

7结果验证：半定量PCR(见注解9)

（1）对每个筛选出来的目标基因，从NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)下载其他动物中的同源基因序列。

（2）从下拉菜单中选择「nucleotide」，输人目标基因的名字或缩写。

（3）得到一个基因的序列后，可以很简单地利用Blast数据库（www.ncbi.nlmnih.gov/BLAST/)搜索获取其他物种同源基因。下载目标基因在多个物种中的同源序列。例如研究松鼠基因时，可以选择其他啮齿类和（或）哺乳动物（例如小鼠、大鼠和人)‘的序列。例如对于冬眠动物的基因，我们一般用人（Homo小家鼠（MmswzmscmZms)和褐家鼠（兄确定同源区域。对进化距离更远的动物来说，选择更具多样性的基因和（或）来自与目标物种系统发育上更接近物种的基因会更加有效。例如分析一个海龟的基因时，选择蛙类、鸡和大鼠的序列进行初始分析会更合适。一般选择3个同源序列就足够，但是要对一个基因进行更深人的研究，可以选择多个序列进行分析。

8展望一微阵列数据的可比性，比较基因组学和冬眠

对于DNA阵列分析，早期人们比较担心的是缺少能够收纳研究产生的大量信息的公共领域（48-50)。解决方法是创建特别的公共数据库，研究者可以通过这种数据库的免费使用接触到大量微阵列数据，从而促进一些看上去不相关的领域的快速发展。举例来说，一个研究者在研究某一特定基因时，可以通过查询各种各样的微阵列数据来确定这个基因的时空表达情况，从而提出与其他基因相关的基因调控的假设。这正是NIH引入的基因表达数据库（GEO)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的目的（51，52)。同时还有其他的微阵列数据库，比如Standford大学微阵列数据库[StandfordUniversityMicroarrayDatabase(http：/7genome-www5.Stanford,edu/)],列出了公共数据、参考文献和数据来源的物种；欧洲生物信息学研究院（EuropeanBioinformaticsInstitute)的ArrayExpress数据库（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)(53-56)，功能与NIHGEO数据库相似，包括覆盖了至少35个物种的超过12000个杂交的数据。目前为止，GEO是最大最全的开放数据库，提供科学家免费查询获得的高通量数据，这些数据涉及mRNA表达、基因组DNA分析、基因表达系列分析（SAGE)、质谱和蛋白质组学等方面。虽然这些数据库非常有用，特别是对于模式生物的研究者，但是它们最近才开始被从事比较学研究的人所使用。
很明显通过跨物种的异源微阵列分析，比较研究学家能够极大地提高他们的研究产出。下列两种情况不能采用跨物种的异源阵列筛选方法：（1)阵列和目标物种基因之间的同源性太低；（2)对某一特定物种特异的新发现的基因，从而在商品化的阵列上没有对应同源物。但越来越多的新物种阵列正在不停地产生，所以某种程度上来说，当与目标物种系统发育上接近的物种有可用的阵列时，上述两个问题都能被克服。例如在冬眠研究领域，MattAndrews实验室（57)最•近用来自于墨西哥黄鼠(S.irzWecemGweatos)cDNA文库中的4000多个cDNA制备了一’个DNA阵列，并用这个阵列进行冬眠期间心脏内转录组的分析。由于阵列上只点了4000个基因，基因组的很大一部分未列在其中，因此目前来说，异源杂交得到的结果更具有广泛性，比如我们
地松鼠的cDNA和商品化的人19OOO个基因的阵列杂交，杂交度达到85%〜90%。但是，用物种特异的阵列有机会发现只存在于冬眠动物中的新基因（即人类的基因组中没有的基因），因此物种特异的阵列在冬眠表型的遗传分析中有着不可取代的作用。
由于不管使用何种阵列平台，阵列筛选之后必然进行的是严格的后续分析，所以这对使用异源cDNA阵列杂交的比较生物学家来说是一个优势，特别是在目标物种与模式物种有较高同源性的情况下。由于全世界的生物学工作者都在对非传统模式物种的基因组进行测序，包括人类基因组计划指定要进行全基因组测序的墨西哥黄鼠，异源微阵列分析领域在未来几年中必将有很大的发展。对多物种的基因和基因结构的注释和分析将为精确的基因鉴定和同源性分析提供可能，并且进一步确认异源微阵列对未来比较生物学家的跨物种工作的重要价值。

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注意事项

（1）任何阵列研究很重要的部分是确定实验路线和合适的对照。在所有的科学工作中，选择合适的对照条件是恰当诠释处理条件下基因表达变化的关键因素。这点在阵列筛选研究中看上去尤其重要，因为这种研究进行的是mRNA的分析，而mRNA在细胞中半衰期极短，所以对阵列研究来说最好能选择在时间和处理前状态上尽可能相似的对照和实验组样品，目前冬眠研究领域的一个现有的争论提供了很好的例子。我们想要了解蛰伏的调控机制以及什么基因的表达需要被上调从而帮助动物进人蛰伏状态和（或）稳定代谢，活过这个很长的蛰伏期^因此我们选择了尽可能相似的对照和实验组动物：在这个实验中，对照组是体温37°C的动物，它们在一个5°C的房间里但还没进人冬眠，而实验组动物是在同一个房间内已进入蛰伏期的动物，它们的体温已接近室温。这样我们就可以得到活跃状态和蛰伏状态基因表达的差异。与此相反，一些其他的研究小组提倡用夏季活跃的动物与冬天进入费伏期的动物进行比较（58)。这样做可以体现器官中mRNA的季节差异但对于冬眠调控的研究来说是不合适的，因为夏季和冬季的动物存在太多差异，包括环境条件（例如光周期和温周期）、生理状态(例如进食活跃与否，•夏季动物地上频繁活动对比冬季蛰伏动物在洞穴中进行睡眠），以及生殖状态。这种差异使得我们不可能「切割，，出蛰伏特异的基因表达变化来单独研究。因此夏季活跃的动物可以说是一个极为糟糕的生物学对照，更可以说是一个错误的时间点，对冬眠的整体研究是一个毁灭性的因素。事实上，应用我们的实验体系（恒温的相对于蛰伏的动物）进行基因筛选，结果显示当动物进人蜜伏期后有大量基因的表达被特异性地诱导；这些基因看上去在蛰伏状态下发挥着不可或缺的生物学功能。相对于恒温的对照组，我们也在蛰伏实验组中发现了应激诱导的信号转导途径发生了广泛的器官特异性的激活，
其中包括了丝裂原激活蛋白激酶（17,59)，说明蛰伏期间体内器官还是维持了基本的代谢活性。这些发现实际上与一些之前冬眠研究中所谓的「常规的经验」相反，它们认为蛰伏期间大多数的生物进程都减弱或干脆停止。

（2）值得注意的是我们用KinexusKinetworks™磷酸化蛋白（表2)进行的应激标记物筛选，结果显示了选定的蛋白质在冬眠期的墨西哥黄鼠肝脏中磷酸化状态有所改变，对冬眠动物在蛰伏期体内确实维持了一定的代谢活性这个概念是一个有力的支持。结果显示p38(Thr18°/Tyr182)磷酸化状态没有改变，JUN(Ser73)磷酸化程度的提高，AKT在Ser473而不是Thr3。8位置上磷酸化程度的降低。我们的数据与之前对贝氏黄鼠（S.Hckr心和墨西哥黄鼠的研究结果一致：蛰伏期间，P38活性不发生变化，而磷酸化JUN的上游激酶JNK的活性则被大幅度提高（59);而之前对墨西哥黄鼠的研究也显示在蛰伏和冬眠期间AKT在Ser473而不是Thria8位置上磷酸化程度的降低（60）。因此阵列筛选的数据与很多传统实验体系得到的数据是相吻合的。

（3）微阵列分析所用的cDNA探针要进行荧光或放射标记。荧光探针专用于高密度的DNA微阵列,32P标记的探针一般用于宏阵列，像ClontechATLAS™阵列。异源杂交实验中，根据我们的经验当满足以下几个条件时，实验会很成功：
a.两个物种间基因的同源性较高（检测物种相对于制备阵列的物种）。