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biopioneerinc/Blunt End PCR Cloning Kit with Competent cells, 20 reactions/1/PCK-102
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4000-520-616
BP-Blunt TM Cloning Kit
Technical information:
For cloning PCR product generated with high fidelityDNA polymerase
Cat No. PKC-101 (without competent cells)
Cat No. PKC-102 (with competent cells)
Kit contents:
pBP-Blunt Vector (5-10 mg/ml)20 ul
6X Reaction Solution50 ul
(1.2 M NaCl, 0.06 M MgCl2)
DH5 alpha Chemically Competent Cells 20 x 50 ul
Storage:
pBP-Blunt Vector and X-Gal -20oC or lower
ADH10B Chemically Competent Cells -80oC
6X Reaction Solution4oC or lower
Protocol:
1. Thaw a vial of chemically competent cells on ice, and place S.O.C. medium at room temperature.
2. Warm up a 10 cm LB plus 100 mg/ml kanamycin agar plate to room temperature. Spread 40 ml of 40 mg/ml X-gal on the plate. Keep the plate at 37oC.
3. Set up the ligation reaction by adding the reagents in the following order:
PCR product 0.5-4 ul (containing 5-50 ng DNA)
6X Reaction Solution1 ul
Sterile wateradd to a final volume of 5 ul
pBP-Blunt Vector 1 ul
Total volume 6 ul
4. Mix the reaction gently and incubate at room temperature for 5 minutes. Then place the ligation reaction on ice.
5. Add 2 ul of the ligation reaction to the pre-thawed competent cells and mix gently. Avoid pipetting up and down.
6. Incubate on ice for 30 minutes.
7. Heat-shock the cells at 42oC for 30 seconds. Immediately place the cells on ice for 1-2 minutes.
8. Add 250 ul of room temperature S.O.C. to the cells. Cap the vial and shake it at 200 rpm, 37oC for 1 hour.
9. Spread 50-250 ul of the transformation on the pre-prepared LB agar plate.
10.Pick white colonies and grow them individually in a proper medium.
Note:
1.pBP-Blunt Vector can be used to clone PCR product from tens of bases to at least 5 kb .
2.PCR product must be generated with high fidelity DNA polymerase, and thus the PCR product has blunt ends. For best results, do not use DNA polymerase reagent containing Taq DNA polymerase.
3.PCR primers for PCR reaction must not have 5’ phosphate.
4.pBP-Blunt Vector contains the lacZ-a fragment gene. In the presence of X-gal, the transformants are blue. When inserted into the vector, PCR product will disrupt the expression of lacZ-a fragment and the transformants are white.
5.For best results, PCR product shorter than 2 kb should be column-purified to remove primers and primer-dimers. If longer than 2 kb, it should be gel-purified. Adding PCR product directly to the ligation reaction without purification will increase the background colony number, and thus blue/white screening is essential.
6.If PCR product is copied from a plasmid containing a kanamycin resistant gene, treat the PCR product with Dpn I before purification to destroy the template.
7.For best cloning results, PCR product should be freshly prepared target DNA. Blue and white selection.
The flanking sequences of the cloning sites:
Kpn ISac I BamH I BamH I EcoR V
1caagcttggt accgagctcg gatccactag taacggccgc cagtgtgctg gaattgCccc Tt PCRaagggGcaatt cGGATCCgat atccatcaca
GTTcgAACCA TGGCTCGAGC CTAGGTGATC ATTGCCGGCG GTCACACGAC CTTAACGGGG AA PRODUCTT TCCCcGTTAA GCCTAGGCTA TAGGTAGTGT
Not I T7 Promoter
94 CTggcggccgct cgagcatgca GCTCGTACGTtctagagggc ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattac
GACCGCCGGCGA GCTCGTACGT CGAGCATGCA AGATCTCCCG GGTTAAGCGG GATATCACTC AGCATAATG
Topoisomerase site 162
Topoisomerase site 263
T7 promoter (c)137-153
T7 primer134-153
M13 (-20) forward primer161-176
M13 (-40 forward primer 180-196
f1 origin 317-755
Kan promoter 951-1088
Kanamycin resistant gene 1089-1883
pUC origin2562-3235
lac promoter 3452-3573
lac repressor binding site3536-3556
M13 reverse primer3562-3578
(c) = complementary strand
Trouble shooting:
Problem | Possible cause | Solution |
Few or no colonies, but a positive control plasmid yielded normal number of colonies | Did not use high fidelity DNA polymerase in PCR. | Perform PCR with high fidelity DNA polymerase. |
PCR primers have 5" phosphate. | Do not use 5" phosphorylated primers in PCR. | |
Few or no colonies and even a positive control plasmid did not yield a normal number of colonies | Competent cells have low transformation efficiency. | Us fresh competent cells with a transformation efficiency > 108/mg pUC19 for transformation. |
Few white colonies and most of the colonies had a blue spot in the middle | Too much primers or primer-dimers present in the ligation reaction. | Purify PCR product to remove primers and primer-dimers. |
Few colonies containing the correct PCR product | Too many nonspecific PCR products in the ligation reaction. | Gel-purify the expected DNA band from PCR product. |
Biopioneer Brand:
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2021-07-16
医流商城提供ALK基因重排探针报价、参数、图片、特点、咨询等有效信息,100%正品保证,是您网上购买ALK基因重排探针的放心平台 查看更多
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2021-09-22
上海晶莱生物技术有限公司在发布的探针合成实验服务供应信息，浏览与探针合成实验服务相关的产品或在搜索更多与探针合成实验服务相关的内容。 查看更多
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2018-03-16
北京孚博生物科技有限公司在发布的EML4 Breakapart 探针供应信息，浏览与EML4 Breakapart 探针相关的产品或在搜索更多与EML4 Breakapart 探针相关的内容。 查看更多
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2021-09-12
货号：168-27091、161-27101 查看更多
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2021-09-04
北京孚博生物科技有限公司在发布的FGFR1 Breakapart/Amplification 探针供应信息，浏览与FGFR1 Breakapart/Amplification 探针相关的产品或在搜索更多与FGFR1 Breakapart/Amplification 探针相关的内容。 查看更多
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2021-08-08
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2021-07-25
上海臻诺生物科技有限公司在发布的Roche 现货FastStart Universal Probe Mast探针法定量试剂4913957001供应信息，浏览与Roche 现货FastStart Universal Probe Mast探针法定量试剂4913957001相关的产品或在搜索更多与Roche 现货FastStart Universal Probe Mast探针法定量试剂4913957001相关的内容。 查看更多
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2021-08-11
在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其 荧光性质（激发和发射波长、 强度、寿命、 偏振等）可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。... 查看更多
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2021-09-10
EMSA探针－C/EBP(1.75μM)是由江阴齐氏生物科技有限公司代理或销售的CHI品牌的试剂，产品来源于USA。江阴齐氏生物科技有限公司是中国最权威的EMSA探针－C/EBP(1.75μM)试剂销售服务商之一，在无锡等地方销售EMSA探针－C/EBP(1.75μM)试剂已经多年。生物在线为您提供众多企业EMSA探针－C/EBP(1.75μM)仪器产品及图片，以便挑选到性价比高，合适的EMSA探针－C/EBP(1.75μM)产品 查看更多
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2021-09-01
货号：FXP136-100 查看更多
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2021-08-17
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如何设计荧光定量PCR的引物及TaqMan探针123
医术仁生2016-11-08
普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的区别123
满1990满2021-07-27
两者间用的引物有什么区别，可以用一样的序列去设计吗
两种一抗,分别是抗小鼠和抗兔的,二抗如何选择123
书生·螺n2021-08-08
26.基因探针可以是DNA双链、DNA单链或RNA单链，但探针的核苷酸序列是已知的（如测某人是否患镰刀型贫血症），则探针是放射性同位素标记或荧光标记的镰刀型贫血症患者的DNA作为探针。
为什么Taqman探针要靠近上游引物 分子生物 PCR相关 ...123
1234yywzy2021-07-25
不一定。
【求助】引物与探针的设计?急求! PCR技术讨论版123
996906504mm2021-08-19
探针与引物的区别 匠子生活123
capitalbio52021-08-14
基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。
引物，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。
引物，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。
免疫学实验一抗,二抗的选择与搭配原则和方法.ppt文档全文免费阅读...123
2018-03-25
探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA（或RNA）分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术叫核酸探针技术。探针制备就是将目的基因进行标记。特异性探针有三种形式——cDNA、RNA、寡核苷酸。cDNA和寡核苷酸是目前最常采用的探针。RNA探针用途很广，也容易获得，但其不稳定性限制了其商业用途。cDNA探针的获得是，将特定的基因片段装载到质粒或噬菌体中，经过扩增、酶切、纯化等复杂的步骤，才能得到一定长度的cDNA探针。这一过程比较复杂，有相应条件的实验室才能做到。寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下，由核酸合成仪来完成，可廉价获得大量的此类探针。质量也相对来说更为稳定。由于cDNA探针长度通常为数百至数千个碱基，所以有良好的信号放大作用，但其渗透性比较差。寡核苷酸探针一般为十数个至数十个碱基，渗透性强，但信号放大作用则较差，合成的多相寡核苷酸探针，敏感性可以达到cDNA探针水平。
探针的标记方式有放射性标记和非放射性标记。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记。特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高。用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期短，虽使用不方便，但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，现有许多商品是生物素、地高辛标记的。血凝素与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶，经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶复合物（ABC法），酶催化底物显色，观察结果。ABC法底物显色生成不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差，成本高，但便于运输、保存，灵敏度与放射物标记法相当。 ①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口，然后DNA聚合酶I沿缺口水解5´端核苷酸，同时在3´端修复加入被标记核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀，多用于大分子DNA标记，(>1000bp最好)，但单链DNA、RNA不能用该法标记。
②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段（KlenowFragment）催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应体系中含有a-32P-dNTP时，即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。
③末端标记法（又叫尾标）。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测，该探针可用核酸合成仪人工合成，克隆出的探针一般较长，特异性好，标记量大，杂交的检出信号强。 1、4—6微米切片，用防脱片胶（多聚赖氨酸）处理过的玻片贴附
2、56—60℃烤片2—16h
3、新鲜二甲苯脱蜡，10minX2（趁热脱蜡）
4、100%乙醇5minX2次，不用浸水，直接空气干燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液（蛋白酶K用蒸馏水稀释，浓度为25μg/ml），37℃消化10—15min
6、弃去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗涤3minX3次逐级酒精脱水（85%，95%，100%酒精）1minX3次然后空气干燥
7、加入20μl探针，加盖薄膜。（探针用预杂交液稀释，浓度为5μg/ml）。
8、95℃变性10—12min；立刻置于冰块上，防止复性。
9、37℃杂交16—20h
10、揭去薄膜，每张切片加入以下杂交后洗涤液：
>用2—3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.5XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.2XSSC37℃洗涤3minX2次；
11、0.1MPBS/TBS缓冲液洗涤，1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育45—60min；
13、0.1MPBS浸洗，5minX3次
14、滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液，37℃孵育45—60min。
15、0.1MPBS浸洗，5minX3次
16、滴加NBT/BCIP显色6—16h，
17、双蒸水终止反应（37℃10min—2h），双蒸水浸洗，5minX2次
18、滴加核固红，30秒—5min；
19、双蒸水浸洗，5minX3次
20、脱水、透明、封片
探针的标记方式有放射性标记和非放射性标记。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记。特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高。用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期短，虽使用不方便，但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，现有许多商品是生物素、地高辛标记的。血凝素与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶，经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶复合物（ABC法），酶催化底物显色，观察结果。ABC法底物显色生成不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差，成本高，但便于运输、保存，灵敏度与放射物标记法相当。 ①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口，然后DNA聚合酶I沿缺口水解5´端核苷酸，同时在3´端修复加入被标记核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀，多用于大分子DNA标记，(>1000bp最好)，但单链DNA、RNA不能用该法标记。
②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段（KlenowFragment）催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应体系中含有a-32P-dNTP时，即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。
③末端标记法（又叫尾标）。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测，该探针可用核酸合成仪人工合成，克隆出的探针一般较长，特异性好，标记量大，杂交的检出信号强。 1、4—6微米切片，用防脱片胶（多聚赖氨酸）处理过的玻片贴附
2、56—60℃烤片2—16h
3、新鲜二甲苯脱蜡，10minX2（趁热脱蜡）
4、100%乙醇5minX2次，不用浸水，直接空气干燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液（蛋白酶K用蒸馏水稀释，浓度为25μg/ml），37℃消化10—15min
6、弃去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗涤3minX3次逐级酒精脱水（85%，95%，100%酒精）1minX3次然后空气干燥
7、加入20μl探针，加盖薄膜。（探针用预杂交液稀释，浓度为5μg/ml）。
8、95℃变性10—12min；立刻置于冰块上，防止复性。
9、37℃杂交16—20h
10、揭去薄膜，每张切片加入以下杂交后洗涤液：
>用2—3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.5XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.2XSSC37℃洗涤3minX2次；
11、0.1MPBS/TBS缓冲液洗涤，1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育45—60min；
13、0.1MPBS浸洗，5minX3次
14、滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液，37℃孵育45—60min。
15、0.1MPBS浸洗，5minX3次
16、滴加NBT/BCIP显色6—16h，
17、双蒸水终止反应（37℃10min—2h），双蒸水浸洗，5minX2次
18、滴加核固红，30秒—5min；
19、双蒸水浸洗，5minX3次
20、脱水、透明、封片
这是我第一次独立设计引物和探针,请各位高手评价一下 PCR技术...123
wj0101wj2021-08-11
高中生物pcr技术扩增的是两引物之间的核苷酸序列是什么意思已知...123
不是胡萝卜须2018-01-23
PCR技术中扩增的是两引物之间的核苷酸序列，意思是采用该技术，可以大量扩增引物之间的序列，一般情况下，我们需要大量的某一基因的片段时，我们在基因的两端分别设计引物（一段一条），然后在体外，采用PCR的方法，用引物进行体外DNA复制，从而大量合成引物之间的基因。
PCR即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
其原理为：
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
其原理为：
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
引物探针引物和探针有什么区别吗123
如琬似花10fP2021-08-02
如果你做的事荧光定量PCR，其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的，只是要更加注意引物二聚体、PCR产物大小等问题。染料法不需要其他东西，探针法还需要taqman探针，这个探针的设计是比较有讲究的，并且上面有荧光集团和猝灭基团。具体设计，一般使用相关软件进行。
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wbcldx2018-01-23
通常不会通用的。除了引物设计的一些基本原则以外，他俩的引物设计要求是不一样的。
原位杂交引物要求：
1. 为了避免检测mRNA时基因组序列的干扰,设计探针时尽量选择在跨内含子的部位。
2. 通常探针的长度（既PCR产物长度）以100-400bp为宜，过长不易穿透组织，杂交效率减低；过短特异性低。
而Realtime引物设计：
1.产物长度80-150bp为宜，可延伸到300bp。
而且你做实时定量的时候，还要做标准曲线，确定引物的扩增效率好不好。
原位杂交引物要求：
1. 为了避免检测mRNA时基因组序列的干扰,设计探针时尽量选择在跨内含子的部位。
2. 通常探针的长度（既PCR产物长度）以100-400bp为宜，过长不易穿透组织，杂交效率减低；过短特异性低。
而Realtime引物设计：
1.产物长度80-150bp为宜，可延伸到300bp。
而且你做实时定量的时候，还要做标准曲线，确定引物的扩增效率好不好。
荧光定量PCR(SYBR Green)详细操作步骤123
犹豫的汉堡2021-07-20
可以事先混合，混合液作为实时荧光用的最好还是现配现用，毕竟这是一个反应比较灵敏的实验。
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