底物范围较广，包括二氨基联苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。
二氨基联苯胺／金属盐
DAB是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。它产生强烈的棕色产物，在水和醇中不溶解。多数情况下，推荐在DAB中加入不同的金属离子。当加入金属盐如钴、镍至底物液中，辣根过氧化物酶可以更加敏感。此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色，且在水及醇中稳定。DAB／金属盐染色应用的组织染色范围较广。
1．需要的溶液和特殊设备
DAB，0．05mol／LTris缓冲液(pH7．6)；
0．3％(W／V)氯化镍／水贮存液；
30％过氧化氢；
DPX。
光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)
2．操作步骤
(1)用9ml0．05mol／LTris缓冲液(pH7．6)溶解6mgDAB；
(2)加lml0．3％(W／V)氯化镍／水贮存液(也可以用等量的氯化钴替代)；
(3)加0．1m13％过氧化氢。过氧化氢一般以30％的溶液提供，贮存在4E，此条件可以持续1个月；
(4)如果出现沉淀，用滤纸过滤；
(5)加此溶液至标本，并孵育1—20min水洗终止反应；
(6)优化：如果需要可复染；
(7)用DPX封片。
氯萘酚
氯萘酚可以形成一种蓝黑色产物。敏感性低于DAB，且产物可溶于醇中。它适用于当DAB反应形成较高背景或要求改变产物的颜色。
1.需要的溶液和特殊设备
0，03％氯萘酚，用无水乙醇溶解(贮存在-20℃)，0．05mol／LTris(pH7．6)
过氧化氢；
Gelvatol或者Mowiol。
光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。
2．操作步骤
(1)氯萘酚贮存液的准备：用10ml无水乙醇溶解0．3g氯萘酚，贮存于—20℃；
(2)加100ul氯萘酚贮存液至10ml0．05mol／LTris(pH7．6)，
(3)加0．1ml3％过氧化氢于水中。过氧化氢一般是以30％的溶液提供，4℃可存放1个月；
(4)白色沉淀可用滤纸过滤去除；
(5)加此溶液到标本中，并在室温孵育10～40min，水洗终止反应；
(6)优化：如果需要，进行复染，但只可使用水溶性染料；
(7)用Gelvatol或者Mowiol封片。
氨乙基咔唑
氨乙基咔唑(AEC)产生红色产物，其敏感性低于DAB，但可用于DAB反应产生较高背景或要求改变产物颜色的试验。此产物可溶于醇，但不溶于水。
1．需要的溶液和特殊设备
0．4％AEC用N，N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解；
0．1mol／L乙酸钠缓冲液(pH5．2)；
过氧化氢；
Gelvatol或Mowi01．
光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。
2．操作步骤
(1)用lmlDMF溶解4mgAEC。AEC在DMF中稳定，因此，可以用100mlDMF溶解0．4gAEC作为贮存液备用；
(2)加lmlAEC溶液至15ml0．1mol／L的乙酸钠缓冲液(pH5．2)中，并搅拌；
(3)加0．15ml3％过氧化氢于水中。过氧化氢一般是30％的溶液提供，在4℃可存放1个月；
(4)用滤纸过滤；
(5)加此溶液到标本中，并于室温孵育10～40min，水洗终止反应；
(6)优化：如果需要复染，只可用水溶性染料；
(7)用Gelvatol或Mowiol封片。
