Description | FLPrecombinasecatalyzesthesite-specificrecombinationofDNAbetweenFRTsites.Ithasbeenwidelyusedforgeneratingconditionalknockoutmice,mediatedbyFLP/FRTsystem. RecentstudiesdemonstatedthatpseudouridinemodifiedmRNAsignaficantlyreducePKRactivationincells,therebyenhancestranslationoftheencodedproteinafterbeingdeliveredintoculturecellsorinjectedintoanimals. Pseudouridinemodified5'Anti-ReverseCapAnalog(ARCA)cappedNLS-hFLPrecombinase(humancodon-optimizedNLS-hFLP)mRNAhasbeentestedforFRTrecombinationinFRT-RFP-Stop-FRT-GFPreportercells(e.g.,HEK293,Hela,andNIH3T3),andprimarycells. |
Applications |
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Size | 5µg |
TransfectionProtocols | 1.InvitrogenRNAiMAXmRNATransfectionProtocol |
Storage | -20°Cor-80°C |
Shipping | dryice |
References |
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如题,我现在做出了一个蛋白相对于正常组织,在肿瘤里表达升高。想做某转录因子调控它的表达。查了转录因子预测的网站,每个预测的都很不一样,而且参与其调控的转录因子有几十个。我该怎么办呢?用什么实验技术或者方法能找到一个能做的呢?
应用高通量技术进行转录组测序是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。mRNA的转录本表达分析,通过获得研究对象基因组转录区域的信息,鉴定转录发生位点,可变剪切等,其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。
转录是遗传信息由DNA转换到RNA的过程。作为蛋白质生物合成的第一步,转录是mRNA以及非编码RNA(tRNA、rRNA等)的合成步骤。是遗传信息从DNA流向RNA的过程。即以双链DNA中的确定的一条链(模板链用于转录,编码链不用于转录)为模板,以ATP、CTP、GTP、UTP四种核苷三磷酸为原料,在RNA聚合酶催化下合成RNA的过程。
表达谱差异分析(differential expression profiling)主要包括基因表达谱(gene expression profiling) 和蛋白质表达谱(protein expression profiling) 。大规模表达谱分析已经成为认识疾病分子机制的有利方法,在癌症研究等方面取得了一定的进展。成功的表达谱分析基于实验及其过程分析的有机结合。实验过程从关注的疾病开始,首先收集大量的疾病相关组织样本,样本数量可从10 多个到数百个,但必须足以对每一组织类型及个体差异进行比较分析,而且许多情况下不能仅简单地分为正常和疾病组织。例如,在对糖尿病的研究中,所收集的样本来自健康人、胰岛素耐受和糖尿病病人的不同试验阶段,如胰岛素治疗前后。样品还应包括其他器官的取材,以便进行基因表达的组织分布研究。为了便于对后来的实验数据进行分析管理,需采集并储存所有的组织样本和临床参数。接下来进行组织样本的处理,利用生物芯片(寡核苷酸芯片、cDNA 芯片或全基因组芯片) 进行表达谱测定,并进行生物信息学分析。
通常,表达谱的分析结果需进一步的实验加以证实。定量RT2PCR 是最灵敏的确证方法,该方法还可以将确证实验的范围扩大到原测组织以外的更广泛的组织和组织类型,揭示基因表达的组织分布情况。
确证实验揭示了疾病相关基因。据此,可以进行进一步研究,探索这些基因的功能,开发新的治疗手段。例如,对于正常和疾病组织中表达有显著性变化的基因,可以进行新治疗靶点的鉴定和确定研究,或利用实验和分析工具研究分析其功能;对于疾病组织中活性升高的酶,可以当作前药活化酶进行鉴定研究。典型的表达谱能够显示疾病过程中有大量的已知基因表达的改变,而许多已知基因的代谢通路、表达产物酶学分类和蛋白质功能业已发表,将两者对照分析,可以鉴定出酶活性,选择其中可能成为前药活化酶的部分进行进一步研究;对于疾病特异的蛋白质,可以进行抗原表型分析,决定疫苗的开发策略。
寻找差异表达基因的方法除芯片技术外,一些新的检测方法如差异显示PCR ( differential display PCR, DD-PCR) 、消减杂交( suppression subreactive hy bridization , SSH) 等也相继得到结合应用。
最近导师要求做一个关于PARP家族蛋白在肝癌和癌旁组织中转录以及表达情况的初步研究,以确定目前的课题是否有很大价值。我之前一直在做湿实验,没有生信背景,所以对这个工作比较头疼。我不会编程(只有很浅薄的R基础),而且没有统计学基础,所以直接上网查找有没有可以在网上直接进行分析的网站。我一开始是上cbioportal上对肝癌的mRNA转录谱进行分析(我只会看网站上红得蓝的表达上调下调的标记,不会看zscore什么的。。。),但网站里面提供的对照是一个所谓的标准正常人。我没查到这个所谓的标准正常人是什么,而且导师说肝癌可能存在个体差异,所以要求用肝癌及其对应的癌旁组织的转录谱和表达谱进行分析。我上GEO搜索癌旁组织(paracanceroustissue),根本什么想要的结果都没有。我现在完全是一头雾水,无从下手,希望有做相关领域工作的前辈们或是做与之类似的工作的前辈们提供指导,非常感谢!
基因表达谱测序是直接对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量测序,可以用来研究基因的表达差异情况。该技术结合了转录组测序建库的实验方法,与转录组测序相比,基因表达谱测序要求的读长更短,测序通量更小,但仅可用于基因表达差异的研究。
转录组测序是RNA水平测序,相当于DNA水平的基因组测序,是一个框架。表达谱主要研究的是基因表达量的变化,上调或下降。先要有转录组或是基因组才可以做表达谱,否则没有Ref做参考。
转录组测序和表达谱测序其实都是通过高通量测序技术进行的,转录组测序主要是针对没有参考基因组(即基因组未完成测序)的物种,侧重于获得你材料的全部转录组信息;而表达谱则侧重于检测各个基因的表达量。
转录后要进行加工,转录后的加工包括: 几乎全部的真核 mRNA 端都具“帽子”结构。虽然真核生物的mRNA的转录以嘌呤核苷酸三磷酸(pppAG或pppG)领头,但在5’端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸(m7GpppAGpNp)。mRNA 5’端的这种结构称为帽子(cap)。不同真核生物的mRNA具有不同的帽子。
mRNA的帽结构功能:①能被核糖体小亚基识别,促使mRNA和核糖体的结合;②m7Gppp结构能有效地封闭RNA 5’末端,以保护mRNA免疫5’核酸外切酶的降解,增强mRNA的稳定性。 (postranslational processing):从核糖体上释放出来的多肽需要进一步加工修饰才能形成具有生物活性的蛋白质。翻译后的肽链加工包括肽链切断,某些氨基酸的羟基化、磷酸化、乙酰化、糖基化等。真核生物在新生手肽链翻译后将甲硫氨酸裂解掉。有一类基因的翻译产物前体含有多种氨基酸顺序,可以切断为不同的蛋白质或肽,称为多蛋白质(polyprotein)。例如胰岛素(insulin)是先合成86个氨基酸的初级翻译产物,称为胰岛素原(proinsulin),胰岛素原包括A、B、C三段,经过加工,切去其中无活性的C肽段,并在A肽和B肽之间形成二硫键,这样才得到由51个氨基酸组成的有活性的胰岛素。向左转|向右转
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