注意
：这是节选操作步骤，详细英文说明书见
http://www.promega.com/tbs/9pim170/9pim170.html
本简明操作步骤电子版见
www.promega.com.cn
cDNA
第一链合成操作步骤：
请使用者准备
：
z
重组
RNasin®
核酸酶抑制剂
(
目录号
N2511)
z
dATP
,10mM(
目录号
U1201,100mM)
z
dCTP
,10mM(
目录号
U1221,100mM)
z
dGTP
,
10mM(
目录号
U1211,100mM)
z
dTTP
,
10mM(
目录号
U1231,100mM)
z
无核酸酶的水
(
目录号
P1193)
1
．
在一支无核酸酶污染的小离心管中加入：
RNA
2ug
引物
1ug
无核酸酶水补齐至
15ul
加热离心管到
70
℃，
5
分钟，
这样可以打开模板的二级
结构。
然后立即在冰上冷却，
以避免重新形成二级结构。
短暂离心，使溶液归于管底。
2.
按以下顺序在复性的引物
/
模板管
(
即以上小离心管
)
中加入下列组分：
注意
：不要改变引物与
mRNA
的比例。
M-MLV
5XReaction
Buffer5ul
dATP
,10mM1.25ul
dCTP
,10mM1.25ul
dGTP
,
10mM1.25ul
dTTP
,
10mM1.25ul
重组
RNasin®
核酸酶抑制剂
25units
M-MLV
反转录酶
200units
加无核酸酶水补齐至
25ul
3.
轻弹离心管混合溶液。
若使用随机引物，
在
37
℃孵
育
60
分钟进行反转录反应；
若使用其它引物
(Oligo
(dT)
或基因特异引物
)
，
则在
42
℃孵育
60
分钟进行
反应。
4.
第二条链合成可使用您选择的操作方法，
也可参考
:
Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.(1989)In:
MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpring
HarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,8.64.
注意
：
M-MLV
反转录酶缓存液与许多下游应用相容。
在进行第二链合成或
PCR
之前，一般无需使用酚抽提
及乙醇沉淀纯化合成的第一链
cDNA
。
普洛麦格
（北京）
生物技术有限公司
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修改于
03/09
