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【求助】western blot 一抗和二抗的来源必须相同吗123
我爱崔Bk22018-03-29
从抗体试剂公司购买。
一抗和二抗的制备方法什么的，推荐阅读“抗体工程”相关的一些文章和书籍。
简单点的信息，可以看百度百科，查阅“一抗“、“二抗”、“抗体”…
一抗和二抗的制备方法什么的，推荐阅读“抗体工程”相关的一些文章和书籍。
简单点的信息，可以看百度百科，查阅“一抗“、“二抗”、“抗体”…
实验需要的抗体如何选择一抗或二抗123
2021-07-21
如何选择 一抗 二抗！ 你真是问对人了！我现在就告诉你如何选择实验需要的抗体！最优回答注意看哦！
1. 一抗选择
（1）确定抗体的名字，注意中英文名字、别名、亚型等信息。
（2）确定您的实验类型，Elisa，WB，IHC，ICC，或者是FACS。biorbyt的每种抗体说明书都会列出抗体经验证过适用的实验类型，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种实验验证。
（3）确定实验样本的种属，Human，Mouse，Rat等。我们的抗体说明书都列出该抗体验证过的适用物种，可根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验需要的抗体。
（4）样本抗原蛋白的结构性质。了解样本抗原蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性，蛋白空间构象的改变，会影响抗体的免疫亲和反应。
（5）单多克隆抗体的选择。一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
2. 二抗选择
（1）种属来源。主要根据一抗种属来源而决定二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。
（2）标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。免疫组化，WB二抗主要选择HRP，Biotin标记的二抗，而免疫荧光染色可按实验需要选择不同荧光素标记的二抗，如FITC、Cy3、PE等。
详情可搜索博欧特生物
1. 一抗选择
（1）确定抗体的名字，注意中英文名字、别名、亚型等信息。
（2）确定您的实验类型，Elisa，WB，IHC，ICC，或者是FACS。biorbyt的每种抗体说明书都会列出抗体经验证过适用的实验类型，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种实验验证。
（3）确定实验样本的种属，Human，Mouse，Rat等。我们的抗体说明书都列出该抗体验证过的适用物种，可根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验需要的抗体。
（4）样本抗原蛋白的结构性质。了解样本抗原蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性，蛋白空间构象的改变，会影响抗体的免疫亲和反应。
（5）单多克隆抗体的选择。一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
2. 二抗选择
（1）种属来源。主要根据一抗种属来源而决定二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。
（2）标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。免疫组化，WB二抗主要选择HRP，Biotin标记的二抗，而免疫荧光染色可按实验需要选择不同荧光素标记的二抗，如FITC、Cy3、PE等。
详情可搜索博欧特生物
透明质酸酶做western blot 选择什么试剂做一抗体和二抗 123
dxy_2hylobx42021-07-22
我的是一抗是羊抗兔的,那么我的二抗应该怎么选择?是抗兔还是抗羊...123
谭玉军0072021-07-22
当然是抗羊的了，你别管是什么抗羊，你的一抗肯定是羊身体里出来的抗体，二抗要针对你的一抗了，所以选抗羊的。
Western Blot 中一抗二抗怎么选择? 动植物与海洋生物论坛123
陡变吧BTD2018-03-26
首先确定你所选的检测蛋白的状态，比如有无标签，如6*HIS等。
选择一抗就根据检测蛋白的状态来选，如果有蛋白带标签，就选针对标签的抗体。
如果没有标签，那么就要自己制备一抗。
二抗的选择则主要根据一抗的来源来选择，如果一抗是鼠源的，二抗一般就选用羊抗鼠的就可以了。
选择一抗就根据检测蛋白的状态来选，如果有蛋白带标签，就选针对标签的抗体。
如果没有标签，那么就要自己制备一抗。
二抗的选择则主要根据一抗的来源来选择，如果一抗是鼠源的，二抗一般就选用羊抗鼠的就可以了。
求助稀释好的一抗和二抗一般最多能重复使用几次_问答详情_蚂蚁淘...123
CSU-zw08102017-04-10
如果抗体使用次数太多会使背景变黑吗？
Western Blot 中如何选择内参抗体 实验方法 123
小传君05082018-03-26
内参抗体是个什么鬼？
一抗就是你要检测的目的抗体。
GAPDH作为内参的话，也是要孵它的一抗
一抗就是你要检测的目的抗体。
GAPDH作为内参的话，也是要孵它的一抗
二抗可以回收利用吗?_答魔科研123
11395792021-07-25
【讨论】再谈免疫组织化学Triton X100破膜和二抗封闭原理问题...123
wanliheng2021-07-20
最近一直关注免疫荧光，几个问题问一下：
第一：tritonX-100破膜的原理到底是什么，我以前看过的资料是它是个脂溶性的东东，可以溶解细胞膜和核膜的脂质，从而形成孔洞，让抗体进入，所以有人说tritonx-100又叫打孔剂。一般用0.3%的浓度，PBS稀释。
但是总有人问我，如果是膜蛋白染色，破不破膜？
如果是膜蛋白，要看抗体和抗原的结合位点，如果是跨膜蛋白的话，其结合位点在胞内段的话肯定是需要破膜的。
根据上面的理解，破膜并不会对蛋白造成影响，只是溶解了脂质形成“孔”。
所以我觉得如果条件允许，常规每次都破一下，还是很好的选择。
你的理解是什么呢？
第二：二抗封闭原理的问题。
上一抗之前都要用二抗来源的血清封闭，那么封闭的原理到底是什么。
看资料说是封闭样品中能够与二抗发生非特异性结合位点，降低非特异性显色。用的封闭液是二抗来源的血清。
我的理解：二抗也是抗体，通常用的是说是和一抗的fc端特异性结合的IgG。
如果是减少非特异性结合的话，那么应该是二抗能够跟样品中的某些东西反应，而二抗来源的血清能先进行阻断。
我的问题是：样品中到底是什么物质，可以和二抗来源的血清中的什么物质，进行结合从而阻断。（即样品中，和二抗来源的血清中，分别是两种什么物质发挥作用）；
但是一个新的问题产生了，大家一般多用的是BSA封闭，BSA叫做牛血清白蛋白，他是如何起到封闭作用的呢？
第三：最近做免疫荧光，一个不该在细胞核表达的抗体总是出现细胞核的非特异性染色。
本来我怀疑是抗原弥散了，但是细胞是固定过了的啊，而且同样的方法染色另外一个胞浆表达的抗体，就没有这个问题。
白死不得其解，快要愁死了。
谢谢，请大家指导！
@wh2008
@byd123
@skyskytotop
@甲醛
@多聚甲醛
第一：tritonX-100破膜的原理到底是什么，我以前看过的资料是它是个脂溶性的东东，可以溶解细胞膜和核膜的脂质，从而形成孔洞，让抗体进入，所以有人说tritonx-100又叫打孔剂。一般用0.3%的浓度，PBS稀释。
但是总有人问我，如果是膜蛋白染色，破不破膜？
如果是膜蛋白，要看抗体和抗原的结合位点，如果是跨膜蛋白的话，其结合位点在胞内段的话肯定是需要破膜的。
根据上面的理解，破膜并不会对蛋白造成影响，只是溶解了脂质形成“孔”。
所以我觉得如果条件允许，常规每次都破一下，还是很好的选择。
你的理解是什么呢？
第二：二抗封闭原理的问题。
上一抗之前都要用二抗来源的血清封闭，那么封闭的原理到底是什么。
看资料说是封闭样品中能够与二抗发生非特异性结合位点，降低非特异性显色。用的封闭液是二抗来源的血清。
我的理解：二抗也是抗体，通常用的是说是和一抗的fc端特异性结合的IgG。
如果是减少非特异性结合的话，那么应该是二抗能够跟样品中的某些东西反应，而二抗来源的血清能先进行阻断。
我的问题是：样品中到底是什么物质，可以和二抗来源的血清中的什么物质，进行结合从而阻断。（即样品中，和二抗来源的血清中，分别是两种什么物质发挥作用）；
但是一个新的问题产生了，大家一般多用的是BSA封闭，BSA叫做牛血清白蛋白，他是如何起到封闭作用的呢？
第三：最近做免疫荧光，一个不该在细胞核表达的抗体总是出现细胞核的非特异性染色。
本来我怀疑是抗原弥散了，但是细胞是固定过了的啊，而且同样的方法染色另外一个胞浆表达的抗体，就没有这个问题。
白死不得其解，快要愁死了。
谢谢，请大家指导！
@wh2008
@byd123
@skyskytotop
@甲醛
@多聚甲醛
请问一抗稀释液、二抗稀释液、封闭液三者都是5%BSATBST 吗...123
荒碎玖2021-07-21
【求助】western blotting的一抗用什么溶液稀释? 经验共享 分析...123
国安冠军PO612017-09-28
我用过几种一抗稀释液
1，5%脱脂奶。
2，3%BSA。
3，5%BSA。
以上都可用PBS配，也可用TBST配。个人经验为，抗体背景高时用脱脂奶好；抗体质量好背景低时用BSA配，效价高可节约抗体。
所以，用PBS稀释了没关系，再加入相应脱脂奶粉或BSA即可。
1，5%脱脂奶。
2，3%BSA。
3，5%BSA。
以上都可用PBS配，也可用TBST配。个人经验为，抗体背景高时用脱脂奶好；抗体质量好背景低时用BSA配，效价高可节约抗体。
所以，用PBS稀释了没关系，再加入相应脱脂奶粉或BSA即可。
Western Blotting——封闭,孵一抗,二抗,曝光_一心园123
唯爱一萌3715462018-05-02
将抗体稀释到推荐浓度，这要是看你放膜的容器大小，如果容器刚好和膜差不多，只要配少量的一抗溶液就可以完全覆盖膜，但是如果容器较大，就需要事先看多少ml的溶液才能够用。
抗体溶液倒到膜上后，将容器放到一个水平摇床，或者是染色摇床上，缓慢的摇动。可以在4C过夜孵育，也可以在室温孵育1h即可。
抗体溶液倒到膜上后，将容器放到一个水平摇床，或者是染色摇床上，缓慢的摇动。可以在4C过夜孵育，也可以在室温孵育1h即可。
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