Description
TestedandCertifiedforinvivoimaging(See"LuciferinFAQ"inadditionalinformation)
Luciferinisacommonbioluminescentreporterusedforinvivoimagingoftheexpressionofluciferase.ThiswatersolublesubstrateforthefireflyluciferaseenzymeutilizesATPandMg2+ascofactorstoemitacharacteristicyellow-greenemissioninthepresenceofoxygen,whichshiftstoredlightinvivoat37°C.ThroughtheutilizationofATP,thereactioncanbefurtherusedtoindicatethepresenceofenergyorlifeinordertofunctionasalife-deathstain.
Luciferinisacommonreagentusedthroughoutthebiotechnologyfieldandspecificallyforinvivoimaging.Luciferaselabeledtumorcells,stemcellsorinfectiousdiseasesareofteninoculatedintoresearchanimalssuchasratsormiceforinvestigation.Theinjectionofluciferinallowsforthereal-time,noninvasivemonitoringofdiseaseprogressionand/ordrugefficacyinthesemodelsystemsthroughBioluminescenceImaging(BLI).
Luciferinisalsocommonlyusedforinvitroresearch,includingluciferaseandATPassays,genereporterassays,highthroughputsequencingandvariouscontaminationassays.
FireflyLuciferinisidenticaltoBeetleLuciferin.(See"AdditionalInformation"forstructures.)
ProductSpecifications:
D-Luciferin,SodiumSalt
4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylicacidsodiumsalt
MOLECULARBIOLOGYGRADE(PremiumPure)
Formula:NaC11H7N2O3S2·H2O
MW:320.32g/mol
Color:Lightyellowpowder
Purity:>99%pure(QualityverifiedbynineindependentcriteriaincludingHPLCandFTIR.)
Storage/Handling:Storedesiccatedat-20°C.Protectfromlight.
PubChemChemicalID:23710675
GoldBio活体成像技术:早在1999年由美国哈佛大学Weissleder博士率先提出了分子影像学(molecularimaging,MI)的概念,即应用影像学的方法对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。活体成像便是基于分子影像学孕育而生的,通过这个成像系统,可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移,感染性疾病的发展进程,特定基因的表达等生物学过程。活体成像技术主要采用生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)两种技术。★生物发光是用荧光素酶基因标记细胞或DNA。★荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP,Cyt及dyes等)进行标记。★这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高,不涉及放射性物质和方法,非常安全。操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高。
活体成像两种检测技术介绍活体成像特点优点缺点生物发光检测bioluminescence★荧光素酶(Luciferase)对基因、细胞和活体动物进行标记;★荧光素酶催化底物(例如荧光素钾盐)反应后,会产生化学发光。这种光是由化学反应而来,不需要激发光;★标记方法是通过克隆技术,将荧光素酶的基因插入到预期观察的细胞染色体内,通过对克隆细胞进行筛选,培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。再将细胞株转移至特定的小鼠体内形成模型。★特异性强,无自发荧光;★高灵敏度,在体内可检测到几百个细胞,检测的深度在3-100px;★定量精确 ★信号较弱,检测时间较长;★仪器精密度要求较高;★细胞或基因需要转基因标记;★不可用于人体,不适用于抗体、多肽等标记荧光检测fluorescence★采用荧光报告基因(GFP、RFP等)或荧光染料进行标记;★需要外接激发光源,利用报告基因、荧光蛋白质或染料产生的荧光,就可以形成体内的生物光源。★荧光染料、蛋白标记能力强;★信号强,成像速度快,操作简便,实验成本较低;★未来可用于人;★适用范围广,可以是动物、细胞、微生物,也可以是抗体、药物、纳米材料等。★存在自发荧光,影响灵敏度;★光容易被动物组织吸收;★检测深度受限;★背景光干扰,定量准确度低
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一抗和二抗的制备方法什么的,推荐阅读“抗体工程”相关的一些文章和书籍。
简单点的信息,可以看百度百科,查阅“一抗“、“二抗”、“抗体”…
1. 一抗选择
(1)确定抗体的名字,注意中英文名字、别名、亚型等信息。
(2)确定您的实验类型,Elisa,WB,IHC,ICC,或者是FACS。biorbyt的每种抗体说明书都会列出抗体经验证过适用的实验类型,如果抗体说明书没有提及的应用类型,并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型,而仅是说明尚未经过此种实验验证。
(3)确定实验样本的种属,Human,Mouse,Rat等。我们的抗体说明书都列出该抗体验证过的适用物种,可根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验需要的抗体。
(4)样本抗原蛋白的结构性质。了解样本抗原蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体,待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性,蛋白空间构象的改变,会影响抗体的免疫亲和反应。
(5)单多克隆抗体的选择。一般单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对就低;而多克隆抗体特异性稍弱,但抗体的亲和力强,灵敏度高,但易出现非特异性染色(可以通过封闭等避免)。
2. 二抗选择
(1)种属来源。主要根据一抗种属来源而决定二抗来源,如一抗是小鼠来源,那二抗就买抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。
(2)标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。免疫组化,WB二抗主要选择HRP,Biotin标记的二抗,而免疫荧光染色可按实验需要选择不同荧光素标记的二抗,如FITC、Cy3、PE等。
详情可搜索博欧特生物
选择一抗就根据检测蛋白的状态来选,如果有蛋白带标签,就选针对标签的抗体。
如果没有标签,那么就要自己制备一抗。
二抗的选择则主要根据一抗的来源来选择,如果一抗是鼠源的,二抗一般就选用羊抗鼠的就可以了。
如果抗体使用次数太多会使背景变黑吗?
一抗就是你要检测的目的抗体。
GAPDH作为内参的话,也是要孵它的一抗
第一:tritonX-100破膜的原理到底是什么,我以前看过的资料是它是个脂溶性的东东,可以溶解细胞膜和核膜的脂质,从而形成孔洞,让抗体进入,所以有人说tritonx-100又叫打孔剂。一般用0.3%的浓度,PBS稀释。
但是总有人问我,如果是膜蛋白染色,破不破膜?
如果是膜蛋白,要看抗体和抗原的结合位点,如果是跨膜蛋白的话,其结合位点在胞内段的话肯定是需要破膜的。
根据上面的理解,破膜并不会对蛋白造成影响,只是溶解了脂质形成“孔”。
所以我觉得如果条件允许,常规每次都破一下,还是很好的选择。
你的理解是什么呢?
第二:二抗封闭原理的问题。
上一抗之前都要用二抗来源的血清封闭,那么封闭的原理到底是什么。
看资料说是封闭样品中能够与二抗发生非特异性结合位点,降低非特异性显色。用的封闭液是二抗来源的血清。
我的理解:二抗也是抗体,通常用的是说是和一抗的fc端特异性结合的IgG。
如果是减少非特异性结合的话,那么应该是二抗能够跟样品中的某些东西反应,而二抗来源的血清能先进行阻断。
我的问题是:样品中到底是什么物质,可以和二抗来源的血清中的什么物质,进行结合从而阻断。(即样品中,和二抗来源的血清中,分别是两种什么物质发挥作用);
但是一个新的问题产生了,大家一般多用的是BSA封闭,BSA叫做牛血清白蛋白,他是如何起到封闭作用的呢?
第三:最近做免疫荧光,一个不该在细胞核表达的抗体总是出现细胞核的非特异性染色。
本来我怀疑是抗原弥散了,但是细胞是固定过了的啊,而且同样的方法染色另外一个胞浆表达的抗体,就没有这个问题。
白死不得其解,快要愁死了。
谢谢,请大家指导!
@wh2008
@byd123
@skyskytotop
@甲醛
@多聚甲醛
1,5%脱脂奶。
2,3%BSA。
3,5%BSA。
以上都可用PBS配,也可用TBST配。个人经验为,抗体背景高时用脱脂奶好;抗体质量好背景低时用BSA配,效价高可节约抗体。
所以,用PBS稀释了没关系,再加入相应脱脂奶粉或BSA即可。
抗体溶液倒到膜上后,将容器放到一个水平摇床,或者是染色摇床上,缓慢的摇动。可以在4C过夜孵育,也可以在室温孵育1h即可。
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