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CatalogueNumber | ECM300 |
BrandFamily | Chemicon® |
TradeName |
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Description | QuantiMatrixHumanFibronectinELISA |
Overview | TheQuantiMatrix™ELISAkitforthedeterminationofsolublehumanfibronectinprovidessensitivitydownto10-20ng/mLasdeterminedfromculturesupernatantsandpurifiedproteinsamples. TheassayisintheformatofacompetitiveinhibitionELISA.Humanfibronectinispre-coatedonthewellswiththeexceptionofrowH,whichservesasareference.Standardsandsamplesaredilutedandpre-incubatedwith polyclonalrabbitantibodytohumanfibronectin.Thepolyclonalantibodybindstofibronectininthestandarddilutions,andinthesample,ifpresent.Themixtureisthentransferredtothehumanfibronectin-coatedplate.Freerabbitanti-humanfibronectinbindstothefibronectinontheplate.Goatanti-rabbitIgGHRPconjugatereactswithboundrabbitanti-fibronectin.WhenHRPsubstrateisadded,abluecolordevelops.Thereactionisstoppedbytheadditionofanacid,changingthecolortoyellow.ThiscolorisquantitatedusinganELISAreader;theintensityofthecolorisinverselyproportionaltotheamountoffibronectinintheoriginalsample.Astandardcurveisconstructedandsamplevaluesareinterpolated. |
BackgroundInformation | ThedeterminationoflevelsofextracellularmatrixmoleculesisbecomingmoreimportanttounderstandingalterationsinmatrixfunctionduringdevelopmentandtumOrigenesis.Questionsofmatrixgeneregulationandfunctionrequireasensitivemeansofdeterminingthelevelsofproteinexpressionbycells.TheQuantiMatrix™ELISAkitforthedeterminationofsolublehumanfibronectinprovidessensitivitydownto10-20ng/mLasdeterminedfromculturesupernatantsandpurifiedproteinsamples. TheassayisintheformatofacompetitiveinhibitionELISA.Humanfibronectinispre-coatedonthewellswiththeexceptionofrowH,whichservesasareference.Standardsandsamplesaredilutedandpre-incubatedwithpolyclonalrabbitantibodytohumanfibronectin.Thepolyclonalantibodybindstofibronectininthestandarddilutions,andinthesample,ifpresent.Themixtureisthentransferredtothehumanfibronectin-coatedplate.Freerabbitanti-humanfibronectinbindstothefibronectinontheplate.Goatanti-rabbitIgGHRPconjugatereactswithboundrabbitanti-fibronectin.WhenHRPsubstrateisadded,abluecolordevelops.Thereactionisstoppedbytheadditionofanacid,changingthecolortoyellow.ThiscolorisquantitatedusinganELISAreader;theintensityofthecolorisinverselyproportionaltotheamountoffibronectinintheoriginalsample.Astandardcurveisconstructedandsamplevaluesareinterpolated. |
ProductInformation | |
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Components |
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Detectionmethod | Chromogenic |
StorageandShippingInformation | |
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StorageConditions | Storethekitandallcomponentsat2-8°C. PRECAUTIONS: HumanfibronectinwaspurifiedfromhumanplasmathattestednegativeforHBsAgandHIV.However,allmaterialsshouldbehandledcarefullyandinaccordancewithgoodlaboratorypractices. Theinstructionsprovidedhavebeendesignedtooptimizeperformance.Deviationsfromthesuggestedproceduremayresultinsub-optimalperformanceofthekitandfailuretoproduceaccuratedata. Donotmixorsubstitutereagentsfromdifferentkitlots. |
BIOLOGicalInformation | |
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SpeciesReactivity |
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AnalytesAvailable |
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EntrezGeneNumber | |
EntrezGeneSummary | Thisgeneencodesfibronectin,aglycoproteinpresentinasolubledimericforminplasma,andinadimericormultimericformatthecellsurfaceandinextracellularmatrix.Fibronectinisinvolvedincelladhesionandmigrationprocessesincludingembryogenesis,woundhealing,bloodcoagulation,hostdefense,andmetastasis.Thegenehasthreeregionssubjecttoalternativesplicing,withthepotentialtoproduce20differenttranscriptvariants.However,thefull-lengthnatureofsomevariantshasnotbeendetermined. |
GeneSymbol |
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UniProtNumber | |
UniProtSummary | FUNCTION:SwissProt:P02751#Fibronectinsbindcellsurfacesandvariouscompoundsincludingcollagen,fibrin,heparin,DNA,andactin.Fibronectinsareinvolvedincelladhesion,cellmotility,opsonization,woundhealing,andmaintenanceofcellshape.InteractionwithTNRmediatesinhibitionofcelladhesionandneuriteoutgrowth(Bysimilarity). SIZE:2386aminoacids;262607Da SUBUNIT:Mostlyheterodimersormultimersofalternativelysplicedvariants,connectedby2disulfidebondsnearthecarboxylends;toalesserextenthomodimers.InteractswithFBLN1,AMBP,TNR,LGALS3BPandCOL13A1. SUBCELLULARLOCATION:Secreted,extracellularspace,extracellularmatrix. TISSUESPECIFICITY:PlasmaFN(solubledimericform)issecretedbyhepatocytes.CellularFN(dimericorcross-linkedmultimericforms),madebyfibroblasts,epithelialandothercelltypes,isdepositedasfibrilsintheextracellularmatrix.Ugl-Y1,Ugl-Y2andUgl-Y3arefoundinurine.DEVELOPMENTALSTAGE:Ugl-Y1,Ugl-Y2andUgl-Y3arepresentintheurinefrom0to17yearsofage. PTM:Sulfated. SIMILARITY:SwissProt:P02751##Contains12fibronectintype-Idomains.&Contains2fibronectintype-IIdomains.&Contains16fibronectintype-IIIdomains. |
PhysicochemicalInformation |
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Dimensions |
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MaterialsInformation |
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MaterialsInformation |
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2006年,在完成了对Chemicon、Upstate、Linco等著名品牌的收购之后,密理博生物科学部除了提供传统的除菌过滤、超滤、蛋白质转印、免疫诊断、环境监测等分离纯化产品和技术之外,更增加了实验室研究所需的各种检测试剂、细胞培养产品,主要覆盖干细胞、神经生物学、肿瘤、细胞信号转导、药物开发等领域,从而成为生命科学领域的策略性供应商,为您提供更广泛的研发工具,同步共享全球专业技术,提升您的科研平台,加速您的科研进程。该部门拥有的著名品牌有:Millex、Millicell、Amicon、Durapore、Multiscreen、Montage、Multiplex、Stericup、Chemicon、Upstate、4G10、Luminex、Catch、Release和Beadlyte等。
密理博(Millipore)公司成立于1954年,总部位于美国麻省,在全世界设有47个办事处,为100多个国家提供产品和技术服务。目前全球雇员超过5800人,在美国、法国和日本等国家拥有7家大型生产工厂,主要生产过滤膜及膜过滤产品。
20世纪80年代,密理博公司进入中国市场。先后在香港、北京、上海、广州及成都设立了办事机构,并于2000年4月在上海浦东外高桥保税区建立了密理博(上海)贸易有限公司。
为了更好地满足中国用户的需求,密理博中国主页(www.millipore.com/cn)于2006年11月向广大用户开放,介绍密理博中国有限公司的最新动态,力求为用户打造专业的产品与服务信息交流平台。
产品与服务
密理博公司产品按应用范围可划分为4大部分:实验室纯水、生命科学、膜技术和生物工程及制药。
目前,密理博实验室纯水设备在行业内占据绝对主导地位。从经典的MIlli-Q超纯水系列,Elix纯水系统,RiOs反渗透纯水系统,到新型的Simplicity、Direct-Q等小流量应用系统,密理博的纯水生产设备已成为实验室纯水行业的金标准。膜技术则为免疫诊断试纸条、免疫浓缩检测装置的生产提供全套膜材料,并提供各种材质、孔径的过滤膜及即用式过滤装置,还有专为医疗设备配套的批量供应的一次性过滤器。密理博生命科学的过滤、超滤产品及蛋白印迹系列产品也得到广泛应用,蛋白质组、基因组系列试剂盒以及用于新药开发的多孔滤膜板日益得到用户的认可。2006年,密理博在生命科学领域又迈出了重要一步,完成了对Serologicals公司的合并,这一举措使得产品涉及的广度明显增强,大大加强了Millipore全面服务各个领域的能力,从而进一步确立了密理博的行业领先地位。
除实验室产品外,密理博同样为生物工程和制药企业提供高品质的纯化设备与服务。密理博的滤器、超滤器、反渗透系统、层析系统、层析柱及层析填料,用于药品及生物制品的澄清、分离、纯化、浓缩,和最终产品的除菌、除热原、除病毒,可以满足从小试、中试到大规模生产的各种需求;并可以帮助用户进行过滤、超滤系统的设计、评估及GMP要求的设备验证。此外还提供制药行业、食品饮料行业,微电子行业全面的质量控制产品与服务。
密理博不仅拥有优秀的产品,更提供专业的技术支持服务。在将经销网络覆盖至全国的同时,密理博在全国各省、市、自治区都配备了专业维护工程师,建立了一支技术成熟、认真负责的销售、维修及后勤队伍,以确保中国各个地区的用户都可以方便快捷地得到服务。同时密理博还拥有完善的培训体制,除了每年对公司内部工程师的培训,2006年9月,密理博公司在上海办事处成立了Millipore培训中心,定期为经销商的维修专员进行培训。此外,密理博还在全国多个重点高校和研究机构建立了示范实验室。
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目前,我用该蛋白的鼠源性单抗来包被ELISA板子,5%BSA37度封闭二小时后,洗涤四次后将板子分三个组加入抗原:其中一个组中加入的是我重组的蛋白,另一个组为用其它方法证实含该蛋白的人体内血清,最后一个组加入PBS。37度一小时后洗涤四次后每孔加入我制备的兔源性多抗。37度一小时洗涤六次后我再加入酶标记的抗兔的抗体37度40分钟后洗涤六次后TMB显色。
问题就在我显色后所有的孔都是阳性,其中以抗原为我的重组蛋白组与PBS组OD值最高,两组都可以达到1.8以上,而加入的抗原为人体血清组低,为0.6-1.0不等。
后面我优化条件,封闭液用过5%的脱脂奶粉,2%的BSA,包被的单抗浓度摸了梯度,加入的多抗也摸了梯度,酶标的抗体也摸了梯度。结果都没有改变,连趋势每次都是一样以重组蛋白组与PBS组OD最高。
今天我还试着把抗原换成其它蛋白也做出了强阳性?
请教各位高手,我的ELISA该如何往下面做了啊,是不是我的抗体本身有问题呢?
对了,我包被用的单抗是用GE公司的预装柱纯化的,很纯,在考染中是看不到一条杂带的。
1.标准曲线的标准品是否一定要梯度稀释,为什么?我试过非梯度稀释的,也可以达到线性R2=0.99.
2.我用了CurveExpert做标曲,自动搜索后发现有10种提供的方程,各种形式的,其中一个十分适合我的实验结果(LogisticModel),而其他的感觉又不适合,因为结果常常为负值。这又是为啥捏?
3.实验的酶标仪最大OD值可以测到4,如果我的测量结果在1.3,是否像其他人所说的>1了就不准确了。
4.利用夹心法进行定量分析是否一定要使用线性方程?
不好意思啊,一下问了这么多问题,最近做了一个月的ELISA,完全摸不清头脑啊。谢谢各位了
(1) 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。
(2) 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
(3) 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小时,洗涤。
(4) 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。
(5) 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
(6) 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测O·D值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O·D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
间接法:
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃ 过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。
2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小时,洗涤。
4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分钟。
5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
间接法
1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过夜;
2.次日洗涤3次;
3.加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤;
4.(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml;
5.37℃孵育35-60分钟,洗涤;
6.’最后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
请大家帮帮忙,第一步加完抗原后必须封闭吗
2.加大辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素;
如果用双抗体夹心法,第二个抗体可以用多抗,这样保证你的抗原会被结合,多抗可以直接带HRP标记或者可以用HRP标记二抗去和多抗结合。


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