RNA m6A甲基化修饰是所有高等真核生物中mRNA最丰富的一类转录后修饰。在哺乳动物中,这种修饰是可逆的,并在调节mRNA代谢和加工过程中起着重要作用。2014年,何川课题组曾在Nature Communications报道,除了哺乳动物,拟南芥中也发现大量mRNA发生m6A修饰(Chuan He,Nature Communications,2014),这也是第一次在植物中报道RNA甲基化修饰的存在。但植物中负责RNA表观修饰的酶系至今没有系统性的研究。11月27日,北京大学何川-贾桂芳课题组在植物学TOP期刊Plant Cell(IF:8.688)首次报道,拟南芥mRNA中,存在一种氧化逆转m6A甲基化的去甲基化酶—ALKBH10B,起到延迟开花及抑制营养生长的作用。
1 体外验证ALKBH10B去RNA甲基化作用
AlkB家族酶系在人体RNA m6A去甲基化过程中起主导作用。作者通过同源分析,找到拟南芥中AlkB同源基因—ALKBH9A, ALKBH9B, ALKBH9C, ALKBH10A以及ALKBH10B。在不同的品系中检测AlkB表达量,ALKBH10B均表现为高表达,作者后续主要集中研究ALKBH10B在拟南芥中的去甲基化作用。作者纯化ALKBH10B后,分别与体外合成m6A修饰的RNA片段及拟南芥纯化的mRNA进行体外实验,LC-MS/MS结果证实50%甲基化修饰消失。作者比较了人源ALKBH5去甲基化酶及ALKBH10B的催化活性,结果显示,针对合成无结构m6A修饰RNA,ALKBH5去甲基化活力更高,而对mRNA而言,二者无明显区别。上述结论充分证实ALKBH10B为RNA m6A去甲基化酶。
图注:ALKBH10B 去RNA甲基化作用验证
2 ALKBH10B生理底物为m6A修饰mRNA
体外实验证实ALKBH10B为去甲基化酶之后,需要体内验证ALKBH10B的去甲基化作用。作者在拟南芥体内引入ALKBH10B转录本两个突变型alkbh10b-1(ALKBH10B FeII结合位点前外显子插入T-DNA) 及alkbh10b-2(ALKBH10B预测α-KG结合位点前内含子插入T-DNA)。结果显示alkbh10b-1转录本不在形成ALKBH10B,而alkbh10b-2转录本生成的ALKBH10B只剩5%。分析野生型(Col-0)及alkbh10b-1型植物不同组织,ALKBH10B的破坏将导致体内RNA m6A修饰显著增加。后续,通过回补实验,发现alkbh10b-2植株过表达ALKBH10B后,体内mRNA m6A修饰水平回归正常。上述实验证实ALKBH10B生理底物为m6A修饰mRNA。前人证实体内tRNA及rRNA也会大量发生m6A修饰,但作者发现体内ALKBH10B敲降后,m6A甲基化修饰的tRNA及rRNA未发生明显改变。由于近来RNA甲基化修饰种类很多,作者分别验证了ALKBH10B对mRNA、tRNA及rRNA的m5C、m1A及m1G的去甲基化作用,结果证实ALKBH10B对这些修饰无明显催化活性。综上,ALKBH10B的底物不具有广谱性,而只是针对m6A mRNA发挥去甲基化功能。
图注:ALKBH10B 生理底物为m6A修饰mRNA
3 ALKBH10B植物体内分子功能验证
体内、体外验证ALKBH10B的去甲基化功能后,作者针对其植物表型进行了相关研究。ALKBH10B功能缺失后,植物主要表现为开花延迟以及生长减缓,因此ALKBH10B与植物正常生长密切相关。为了阐释ALKBH10B缺失引起植物表型改变的分子机制,作者检测了ALKBH10B敲降株FTmRNA(FLOWERING LOCUS T:与植物光合作用、成熟及凋亡等通路相关基因)表达量,结果发现其表达显著性下调。结合MeRIP-qPCR实验,作者发现ALKBH10B缺失将显著增加FTmRNA甲基化修饰水平。基于FTmRNA表达受到多基因调控的猜想,作者进行了转录组测序,结果表明SPL3及SPL9表达量与ALKBH10B具有相关性。通过RIP实验,作者发现FT、SPL3及SPL9与ALKBH10B具有直接相互作用。FTmRNA甲基化峰主要位于起始及终止密码子,SPL3及SPL9甲基化峰主要位于3’UTR区。通过一系列机理实验,作者发现ALKBH10B可通过改变SPL3及SPL9转录本甲基化修饰水平,最终影响FTmRNA的稳定性。
图注: ALKBH10B植物体内功能验证 4 ALKBH10B功能缺失广泛降低体内m6A甲基化修饰 为了在组学范围内观察ALKBH10B对mRNA m6A甲基化修饰水平的影响,作者进行了MeRIP-seq及RNA-seq联合分析。最终在野生型植株鉴定到9,210个基因上存在12,922个甲基化修饰峰;alkbh10b-1植株鉴定到8,463个基因上存在12,975个甲基化修饰峰。差异甲基化分析表明,alkbh10b-1植株中共鉴定到1,190个基因,存在1,276过甲基化修饰峰,可能在不同层面调控功能基因的表达。m6A修饰主要分布于mRNA起始、终止密码子及3’UTR区域。通过序列偏好性分析发现,m6A修饰主要集中在RRACH motif。通过GO分析,作者在整体水平上预测了差异甲基化mRNA功能,发现主要与器官组织发育、生殖成熟及开花转换等功能相关,而这也与之前alkbh10b突变植株表型是一致的。上述实验,从微观到宏观全面证实ALKBH10B在拟南芥中具有RNAm6A去甲基化催化活性,影响植株的正常生长与发育。 图注:ALKBH10B功能缺失影响基因m6A修饰 总结: RNA甲基化是近年来新发现的一类表观遗传修饰,功能多样且重要。RNA甲基化需要甲基化转移酶、去甲基化酶及甲基化识别酶共同作用,本文首次发现拟南芥mRNA中,存在一种氧化逆转m6A甲基化的去甲基化酶—ALKBH10B,为研究RNA甲基化修饰酶的诸多学者提供了良好思路。云序生物作为RNA甲基化研究领跑者,提供m6A RNA甲基化测序,m5C RNA甲基化测序及m1A RNA甲基化测序服务,全力助您表观转录组学研究一臂之力。 原文: ALKBH10B is An RNA N6-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition 作者简介: 贾桂芳副研究员,博士导师,2008年获中国农业大学博士学位。2007-2012年,在美国芝加哥大学何川教授实验室从事联合培养博士和博士后研究。发现首个RNA化学修饰N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosion,m6A)的去修饰酶,揭示了RNA修饰动态可逆性,开辟了\"RNA表观遗传学或表观转录组学”全新的研究领域。主要研究植物RNA化学修饰和RNA表观遗传学对拟南芥、水稻等农作物生长发育、胁迫响应的分子调控机制和农艺性状改良研究。目前承担国家自然科学基金、国家重点研发计划重点专项子课题等多项课题。在Nature、Nature Chemical Biology、Nature Communications、Nucleic Acids Research等国际著名期刊发表30多篇高水平SCI论文。 何川教授是美国芝加哥大学教授,北京大学长江讲座教授,美国霍华德•休斯医学研究所(HHMI)研究员。何川教授为RNA表观遗传学领域的奠基人,在DNA表观遗传学测序技术的研究也做了突出的贡献。已国际权威期刊上发表论文245篇,其中多篇Nature、Cell、Science文章。 云序相关推荐: m6ARNA甲基化测序 m5C RNA甲基化测序 全转录组测序 RIP测序 ShanghaiCloud-seq Biotech Co.,Ltd 地址:上海市松江区莘砖公路518号20号楼3楼 电话:021-64878766 网站:www.cloud-seq.com.cn 邮箱:market@cloud-seq.com.cn
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