Your browser does not have JavaScript enabled and some parts of this website will not work without it. 交联 ChIP 的详细步骤和技巧，可用于 ChIP-seq 和 ChIP-qPCR。打印此方案查看 X-ChIP 方案图。ChIP-seq 和 ChIP-qPCR 功能强大，可以实现蛋白质或组蛋白修饰与基因组区域的特异性匹配。分离染色质，使用针对目的抗原的抗体来确定靶标是否与特定的 DNA 序列结合或绘制整个基因组的分布图（微阵列或 DNA 测序）。这可以在空间和时间上进行。本方案提供了如何在细胞上进行 ChIP 的具体细节。使用本方案产生的输出 DNA 既可以在 ChIP-qPCR 中使用 qPCR 分析，也可以在 ChIP-seq 中测序。更多 ChIP 资源和产品阅读本 ChIP 方案后，查看更多 ChIP 检测/染色质免疫沉淀资源和产品，或直接获得重要的 ChIP 数据：- 经过仔细验证的 ChIP 抗体，包括重组兔单克隆抗体，旨在年复一年地提供完全相同的性能- 灵活的染色质提取试剂盒 ab117152，用于提取天然、交联、剪切或未剪切的染色质- 易于上手的 ChIP 试剂盒 ab500，或来自 ChIP 系列试剂盒产品的其他试剂盒。交联和细胞收获甲醛用于蛋白质与 DNA 的交联。交联是一种时间依赖性程序，需要优化。我们建议将样品交联 2 至 30 分钟。过度交联会降低抗原的可及性和超声处理效率。表位也可能被掩盖。加入甘氨酸淬灭甲醛，终止交联反应。从两个 confluent 150 cm2 培养皿开始（每皿 1 × 107–5 × 107 个细胞）。通过直接向培养基中逐滴滴加甲醛，直至终浓度为 0.75%，并在室温 (RT) 下轻轻旋转 10 分钟，将蛋白质与 DNA 交联。向培养基中添加甘氨酸，直至终浓度为 125 mM，室温振荡孵育 5 分钟。用 10 mL 冷 PBS 冲洗细胞两次。加入 5 mL 冷 PBS，用细胞刮刀彻底刮去培养皿，移入 50 mL 管中。向培养皿中添加 3 mL PBS，再次刮片，将剩余细胞转移至 50 mL 管中。离心 5 分钟，4°C，1,000 xg。小心吸取上清液，将沉淀重悬于 ChIP 裂解缓冲液中（每 1 x 107 个细胞 750 μL），冰上孵育 10 分钟。​​使用悬浮细胞时，从 1 × 107–5 × 107 个细胞开始，如上所述，用 0.75% 甲醛和甘氨酸处理（步骤 1）。离心沉淀细胞（5 分钟，1,000 xg）。用冷 PBS 清洗 3 次，用 ChIP 裂解缓冲液重悬沉淀（每 1x107 个细胞 750 μL）。继续步骤 2。超声处理超声处理裂解液，剪切 DNA，使平均片段大小为 200-1000 bp。这一操作需要进一步优化，因为不同细胞系需要的超声处理时间不同。应对交联裂解物进行一段时间的超声处理，以确定最佳条件。应在整个时间进程中取出样品，并按照步骤 3 所述分离 DNA。应在 1.5% 琼脂糖凝胶上分析片段大小，如图 1 所示。超声处理后，离心 10 分钟，4°C，8,000 xg，沉淀细胞碎片，转移上清液至新管中。该染色质制备液将用于步骤 4 中的免疫沉淀 (IP)。取 50 μL 超声处理后的各样品，测定 DNA 浓度和片段大小。​​超声处理后的染色质可在液氮中速冻，并在 -80°C 条件下保存长达 3 个月。避免多次冻融。DNA 浓度和片段大小的测定超声处理后的染色质样品可用于计算后续 IPs 的 DNA 浓度，并测量 DNA 片段大小。在 50 µL 染色质中加入 70 µL 洗脱缓冲液。加入 4.8 µL 5M NaCl 和 2 µL RNase A (10 mg/mL)，在 65°C 条件下振摇孵育过夜。加入 2 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL)，60°C 条件下振摇培养 1 小时。​​使用 PCR 纯化试剂盒时，高水平的 RNA 会干扰 DNA 纯化，因此使用 RNase A 处理样本。色谱柱饱和时，收率会严重降低。用蛋白酶 K 处理样品，该酶裂解邻近脂肪族和芳香族氨基酸羧基的肽键。蛋白质和 DNA 之间的交联被破坏，有助于 DNA 的纯化。使用 PCR 纯化试剂盒或苯酚：氯仿抽提纯化 DNA。为测定 DNA 浓度，取 5 μL 纯化 DNA，转移至含 995 μL TE 的试管中，稀释 200 倍，读取 OD260。DNA 浓度 (μg/mL) 为 OD260 × 10,000。用于计算染色质制备液的 DNA 浓度。在含 100 bp DNA 标志物的 1.5% 琼脂糖凝胶中运行纯化 DNA，以测定片段大小。免疫沉淀使用步骤 2.2 制备的染色质。建议每个 IP 约含 25 μg DNA。用 RIPA 缓冲液按 1:10 的比例稀释每份样品。您将需要一份用于特异性抗体的样本，一份用于对照品（仅限微珠）的样本。取出 50 µL 染色质作为您的输入样本，在 -20°C 条件下保存备用。除仅含微珠的对照品外，在所有样品中加入一抗，在 4°C 条件下旋转 1 小时。加入的抗体量应根据经验确定；通常每 25 μg DNA 加入 1-10 μg 抗体效果良好。蛋白 A/G 微珠的制备：如果同时使用蛋白 A 和蛋白 G 微珠，混合等体积的蛋白 A 和蛋白 G 微珠，在 RIPA 缓冲液中清洗 3 次。吸取 RIPA 缓冲液，加入单链鲱鱼精 DNA，直至微珠终浓度为 75 ng/μL，加入 BSA，直至微珠终浓度为 0.1 μg/μL。加入 RIPA 缓冲液至微珠体积的 2 倍，室温旋转孵育 30 分钟。用 RIPA 缓冲液清洗一次，加入 RIPA 缓冲液至微珠体积的两倍。在所有样品中加入 60 µL 封闭的蛋白 A/G 微珠，4°C 旋转 IP 过夜。​​应使用蛋白 A 微珠、蛋白 G 微珠或两者的混合物。表 1 显示了蛋白 A 和 G 微珠与不同免疫球蛋白同种型的亲和力。将免疫沉淀样品以 2,000 xg 离心 1 分钟，除去上清液。进行以下清洗：在低盐洗涤缓冲液中清洗一次，在高盐洗涤缓冲液中清洗一次，在 LiCl 洗涤缓冲液中清洗一次。每次清洗后，以 2,000 xg 离心 1 分钟，去除上清液。​如果观察到高背景，可能需要额外清洗。或者，在步骤 4.2 之前，与蛋白 A/G 微珠孵育 1 小时，预清除超声处理的染色质。该附加步骤将去除与微珠的任何非特异性结合。将上清液（经超声处理的染色质）转移到新试管中，并按照步骤 4.2 中所述与抗体和微珠一起孵育。交联的洗脱和逆转在蛋白 A/G 微珠中加入 120 μL 洗脱缓冲液，洗脱 DNA，30°C 缓慢涡旋 15 分钟。以 2,000 xg 离心 1 分钟，将上清液转移至新鲜管中。加入 4.8 µL 5 M NaCl 和 2 µL RNase A (10 mg/mL)，在 65°C 条件下振摇孵育过夜。加入 2 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL)，60°C 条件下振摇孵育 1小时。可使用 PCR 纯化试剂盒或酚：氯仿抽提纯化 DNA。ChIP-qPCR 或 ChIP-seq 中的分析DNA 水平常采用实时定量 PCR 法检测。通常使用实时 PCR 仪提供的软件或在线设计工具设计引物和探针。我们的网站上有一些预先设计的引物和探针。或者，使用 ChIP-seq 方法时，可通过测序进行分析。使用本方案产生的 DNA 适合用作测序库制备的输入。我们建议您使用我们的疑难解析提示，针对您的特定实验条件优化本方案。 图 1.超声处理 U2OS 细胞 5、10、15 和 20 分钟。片段大小在时间过程中减小。15 分钟时观察到最佳片段大小。注：超声处理时间过长会破坏核小体-DNA 相互作用，因此条带大小应不小于 200 bp。​免疫球蛋白同型种属 免疫球蛋白同种型蛋白 A蛋白 G人 IgG1++++++ IgG2++++++ IgG3-+++ IgG4++++++ IgM使用抗人 IgM使用抗人 IgM IgE-+ IgA-+小鼠IgG1++++ IgG2a++++++ IgG2b++++ IgG3++ IgM使用抗人 IgM使用抗人IgMRat IgG1-+ IgG2a-+++ IgG2b-++ IgG2c+++鸡 所有同种型-++奶牛 所有同种型+++++山羊 所有同种型-++豚鼠 所有同种型+++++仓鼠所有同种型+++马所有同种型+++++猪所有同种型+++兔所有同种型+++++绵羊 所有同种型-++表 1.蛋白 A 和 G 微珠对不同免疫球蛋白同种型的亲和力。溶液ChIP 裂解缓冲液50 mM HEPES-KOH pH7.5140 mM 氯化钠1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) pH81% Triton X-1000.1% 脱氧胆酸钠0.1% SDS蛋白酶抑制剂（每次加入新鲜抑制剂）RIPA 缓冲液50 mM Tris-HCl pH8150 mM 氯化钠2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) pH81% NP-400.5% 脱氧胆酸钠0.1% SDS蛋白酶抑制剂（每次加入新鲜抑制剂）低盐清洗缓冲液0.1% SDS1% Triton X-1002 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)20 mM Tris-HCl pH 8.0150 mM 氯化钠高盐清洗缓冲液0.1% SDS1% Triton X-1002 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)20 mM Tris-HCl pH 8.0500 mM 氯化钠LiCl 清洗缓冲液0.25 M 氯化锂1% NP-401% 脱氧胆酸钠1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)10 mM Tris-HCl pH 8.0TE 缓冲液10 mM Tris pH 8.01 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)洗脱缓冲液1% SDS100mM NaHCO3查看我们其他的表观遗传学方案和技术。