【求助】用质粒PIRES2EGFP转染结肠癌细胞株HCT116后筛选稳转细胞，筛不出来怎么办？
2021-08-07
问题描述：
如题，我用PIRES2-EGFP（带/不带目的基因）转染HCT-116，G418筛选，筛选浓度为800µg/ml,两周后发现克隆要么不带荧光，要么荧光很淡，几乎看不出细胞的轮廓，估计挑出来也没用，请问这是什么原因，我下一步该怎么办？
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wizblue70
用户
继续等待至30天或至45天。对于难转染细胞，总要渡过一段生长调整期的。
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zf3027
用户谢谢wizblue70，顺便问一下，为什么筛选后有的克隆不带荧光依然能在高浓度的G418中存活，而有的细胞克隆两周时观察不带荧光，等待至三周后却出现荧光，可以替我解释一下吗？
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wizblue70
用户在携带抗生素抗性的质粒的帮助下，宿主细胞得以在高浓度的抗生素环境下生存下来。对于难转染的细胞株而言，能生存下来的是少数。在接下来的“挣扎煎熬”中，活下来的宿主细胞要将“救命稻草”即抗生素抗性基因优先整合到自己的基因组内，当然，载体上携带的GFP等其它基因也一起整合进入宿主细胞基因组，但是难转染细胞株的自身条件和细胞内抗生素抗性所赋予的抵抗力肯定比那些高转染效率的细胞差多了，难转染细胞可能会（1）通过某种应激反应来关闭暂时不需要的基因的表达，这就包括载体上携带的GFP等外源基因，（2）外源基因片段是随机整合入宿主细胞基因组的，宿主细胞基因组整合点附近可能有主动沉默外源整合基因的某种机制，从而关闭所有外源基因的表达。待渡过一段漫长（10天甚至2个月）的生长阻滞期（或称调整期），“星星之火”-那些熬过来的细胞株终于繁衍昌盛了。但是，要注意，在后期筛选单细胞克隆时就可以发现，虽然都是GFP阳性的，但是靶基因却不一定表达，其机制就如同利用抗生素抗性筛选稳定表达细胞株一样，还是不清楚。
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jbfeng2006
用户我人为，你可能的全序列中的终止密码子没有去掉
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