慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

• 中文名

• 慢病毒

• 外文名

• lentivirus

• 载体基础

• HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）

• 性质

• 基因治疗载体

1. 1基本概述

2. 2应用

3. ▪载体

4. ▪表达载体

1. 3特征比较

2. 4目的与意义

3. 5相关实验

1. ▪实验目的

2. ▪实验流程

3. 6操作手册

• 慢病毒属是反转录病毒科下的一个属，包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴细胞和巨噬细胞为主，感染个体最终发病。慢病毒感染的显著特点是感染个体在出现典型的临床症状之前，大多经历长达数年的潜伏期，之后缓慢发病，因此这些病原体被称为慢病毒。例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性贫血(EIA)、猫免疫缺陷病毒(FIV)都是慢病毒属，慢病毒属的原文是Lentivirus，其中Lenti-在拉丁文中有慢的意思。

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。^[1]

慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带polyA尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stemloop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(smallhairpinRNA,shRNA），载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U3’突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。^[2]

慢病毒载体（Lentiviralvector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。^[3]

慢病毒表达载体，即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色体上，只能进行瞬时感染。与其它逆转录病毒相比，慢病毒（LV）具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答，可作为一种体外基因运输的工具。慢病毒载体介导的转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象。^[4]

慢病毒包装系统一般由慢病毒表达载体和慢病毒包装载体组成。

而慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。

慢病毒包装系统一般都是三质粒或四质粒包装系统。其中四质粒系统比三质粒系统在生物安全性上更好一些，所以应用较多。^[3]

●对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi,CDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。

●进行稳转细胞株的筛选；

●为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；

对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。

1.根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；

2.对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；

3.使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒

液；

4.浓缩、纯化病毒液；

5.用高质量的病毒液感染细胞；

6.通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western分析实验结果；

7.用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进

行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定

性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。^[1]

1慢病毒使用操作

2慢病毒安全使用规范

3悬浮细胞感染方法概要

4相关专业术语（详情可参考公司网站FAQ)

5细胞培养器皿的相关参数

1.慢病毒使用操作手册

1.1慢病毒的储存与稀释：

1.1.1病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂

时放置于4℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）

A．病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在

使用前需要重新滴定病毒滴度

B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中

应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量

进行分装。

1.1.2病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细

胞用PBS或无血清培养基（含血清或含双抗不影响病毒感染）混匀分装后4℃保存（请尽量

在三天内用完）分装后使用。

1.2慢病毒用于体外（InVitro）实验：感染培养原代细胞和建系

细胞

1.2.1慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用InvABIo提供的慢病毒之前可以通过

查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI值）以及在体（In

Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）

1.2.2慢病毒感染目的细胞预实验

1.2.2.1慢病毒感染目的细胞预实验注意事项

A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞（HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。

B．在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有

血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。

C．Invabio提供的病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：

病毒滴度为