一站式慢病毒稳转细胞株筛选构建

1.基因过表达慢病毒稳转细胞株(LentiOE-Stable)

1.    目的基因合成和表达载体构建

1）目的基因合成

2）选择合适的表达载体，目的基因合成后直接连接构建

3）测序验证

2.    表达质粒载体

1）质粒转化细菌扩增

2）质粒抽提纯化

3）酶切电泳以及测序再验证

3.    慢病毒包装

1）试剂：表达载体、慢病毒载体系统、293T细胞和转染试剂

2）共孵育及收集含病毒上清液

3）病毒纯化和浓缩

4）病毒保存（-80℃）

4.    慢病毒感染目的细胞预实验

1）优化条件：细胞种板密度、病毒最适MOI、是否需要polybrene辅助感染试剂等

2）荧光观察或者FACS检测感染效率

5.    药物筛选浓度优化

1）药物浓度梯度

2）处理48小时后细胞全部死亡的最低药物浓度为后续实验拟用浓度

6.    正式实验

1）慢病毒感染

2）荧光观察

3）药物筛选多克隆细胞稳转株（或者FACS分选表达GFP的细胞）

4）有限稀释单克隆细胞株筛选及扩大培养

7.    鉴定

1）荧光拍照

2）目的基因qPCR检测

3）Flag或目的基因表达蛋白的Westernblot检测

 

2.基因敲减慢病毒稳转细胞株(LentiKD-Stable)

1.    选择至少3个不同的靶点，设计shRNAs

2.    合成对应的序列并构建表达载体

3.    后续慢病毒感染细胞及筛选，步骤基本与LentiOE-Stable相同

4.    注意事项

1）单克隆分析前需要筛选出干扰效率最高的siRNA。经抗药基因初步筛选后，提取RNA以qPCR检测目的基因干扰效率。

2）筛选出的siRNA再进行单克隆分析，以qPCR检测筛选出干扰率最高的稳转株，再以WB鉴定选出敲减效果最好的稳转株。

3）需关注细胞存活率和生长状态。某些基因敲减会造成生长缓慢或者致死表型，因此药物筛选会有影响，需要将细胞以低密度种板进行单克隆筛选，或者可选择FACS分选表达GFP的细胞再分析。也可选择可诱导型RNAi表达载体。
 

3.CRISPR基因敲除慢病毒稳转细胞株(LentiCas9-Stable)

1.    选择至少3个不同的靶点

2.    Cas9载体构建

3.    慢病毒感染及筛选同前

说明：本项实验重点在于前期序列设计及载体构建。
 

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