| 实验步骤 | 等电聚焦 等电聚焦是测定抗体等电点（Pl)的一个非常有用的方法。知道抗体的pi将决定在用IEC对抗体纯化时的正确纯化条件以及决定抗体的最佳储存条件。这个结果如同特定的抗体「指纹」，因为抗体根据制备方法的不同可产生一系列等电点电泳条带。抗体的等电点「指纹」在一些条件下会发生明显改变，如保存的缓冲液会发生变化、抗体的脱芻;基，以及抗体是来自体内或者体外培养技术等。 一、试剂注意：因为我们用的是BioRadCriterionCell系统，所以我们用他们的试剂再一次强调，下面内容只是一个例子而并不是必须遵照的。 抗体：样品缓冲液中含1〜2mg/ml 样品缓冲液：含50%甘油的去离子水 IOX阳极缓冲液 IOX阴极缓冲液 IEF标准：pi4.45〜9.6 IEF胶染色液 IEF脱色液 二、仪器CriterionCell系统 Criterion预制胶 三、操作步骤(1)加IOfxl的抗体于戴帽的样品管，再加5uL的甘油。 (2)准备IOjLtl的pi标准品。(3)用IOX储存溶液准备60ml阴极缓冲液。用10X储存溶液准备400ml阳极缓冲液。 (4)从包装中取出预制胶并拔下梳子。用去离子水冲洗。 (5)将预制胶放入CriterionCell系统装置中，将60ml的阴极缓冲液注人上槽中。 (6)将标准品和待测蛋白质样本上样于拔去梳子留下的胶孔。 (7)加400ml阳极缓冲液于下槽中。 (8)盖上电泳槽盖并接通电源。 (9)打开开关,设置电压到100V时电泳2.5h，200V时电泳lh，500V时电泳30min。 (10)运行2.5h后，关闭电源并拔掉导线。打开槽盖从电泳槽中取出胶匣。按照生产商的说明打开胶匣并暴露凝胶。 (11)将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中染色45min。用IOOml的脱色液进行脱色。需要更换脱色液几次。 (12)保存凝胶。凝胶结果可用肉眼观察或进行扫描。 |
|---|
