实验步骤 | 酶免疫分析 酶免疫分析,如ELISA,是免疫分析的主要部分。理解了ELISA的实验原理,就可以理解其他以抗原-抗体反应为基础的实验原理。依据其实验操作程序,我们知道EUSA方法能检测任何给定抗体的特异性、亲和性、浓度及灵敏性。下面是进行直接或间接ELISA的操作步骤。直接与间接ELISA的操作步骤基本是相同的。不同之处是与目标配体相结合的一抗是否是酶标抗体。在直接分析中,一抗是酶标抗体;在间接分析中,一抗不是酶标抗体,酶标记在识别一抗的二抗上。 一、试剂和材料稀释液:150mmol/LPBS,pH7.6 包被缓冲液:200mmol/L碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液,pH9.5 洗漆缓冲液:150mmol/LPBS加0.05%Tween 封闭缓冲液:150mmol/LPBS加1%脱脂奶粉 一抗,交联或不交联酶,如HRP、碱性磷酸酶或者生物素 二抗,与一种酶,如HRP、碱性磷酸酶交联或者与生物素相交联 TMB(酶底物) 终止液:0.6mol/LHCl 二、操作步骤(1)在进行分析前,应首先建立酶标板每孔的加样策略。永远要设立空白孔作为阴性对照。例如,如果打算对血清或者培养上清进行抗体浓度滴定,我们常常是仅在奇数孔包被抗原,而如果是进行杂交瘤的阳性筛选,除了一个或者两个孔留作空白对照外,我们将整块板包被抗原。 (2)进行分析前最好过夜包被酶标板。这样,目标配体便有足够的时间与孔结合。孔板的包被可以放置在4°C,最长时间可达2周。用包被缓冲液稀释配体至2〜5|ixg/ml。每个孔用0.Iml的稀释配体进行包被。 (3)进行分析时,从冰箱里拿出包被板。倒掉孔中的液体,用洗涤缓冲液洗整块孔板3次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。 (4)向所有孔中加300jul的封闭缓冲液。将孔板于室温静置至少30min,然后用洗漆缓冲液洗孔板一次。 (5)在封闭孔板的同时,用PBS稀释一抗。如果是筛选抗血清,我们通常进行5倍的倍比稀释,起始点为1:50或1:100。如要检测培养上清,进行2倍的倍比稀释可能是适当的。如果是检测杂交瘤培养上清,不要做任何的稀释。 (6)如果一抗是酶标抗体,可将其进行1:1〇〇〜1:10〇〇〇稀释。可对几个稀释度的抗体进行测定。 (7)向孔中加人100W稀释的抗体。对于系列稀释的抗体,最好每个稀释度加双份孔(一共4个孔)。37°C孵育孔板30min。 (8)孵育后,用洗涤缓冲液洗板3次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。 (9)如果向孔板加入的是酶标一抗,越过此步而直接进行步骤10。间接分析中,向所有的孔中加人100/zl稀释的酶标二抗。30°C孵育孔板30min。 (11)向所有的孔中加入100/xl的TMB底物。观察颜色的变化。让颜色反应到阴性对照显示轻微的颜色。这种现象未必会发生。如果不发生,5〜IOmin后终止反应。 (12)用50//1的终止液终止反应。 (13)在酶标仪上以适当的吸光波长读取孔板颜色强度的数值。TMB底物自身的背景读数为450nm〇l/L。数值越大,抗体越多。 图7.9显示的是一个滴定结果读数的直方图。一个纯化的单克隆抗体被稀释后加人 |
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