HIC吸附剂的使用方法

1.介绍

HIC吸附剂可直接用于对蛋白质复合物的纯化。其纯化程序由如下一系列步骤组成，本部分将比较详细地介绍该内容。

2.吸附剂的选择

某一给定蛋白质的疏水性通常是未知的，所以在选择最终的吸附剂前，需要进行若干个吸附剂的筛选。筛选过程就是为了测定该吸附剂与蛋白质的结合强度，决定有哪些候选的吸附剂可用于蛋白质的纯化。吸附剂疏水性的初步筛选用于决定复合物的疏水性以及何种吸附剂可以有效纯化蛋白质，筛选应该包括较广范围的疏水性结合特性的吸附剂。
吸附剂可以以预装柱的形式从吸附剂供应商处购买，或需要使用者自行填装。在需要填装层析柱的情况下，应参考供应商的填装说明。可采用与理论塔板髙度相当的尺寸来验证层析柱是否正确填装。一旦填装好，吸附剂供应商通常会提供一些操作使用范围的建议，包括允许的流速范围、层析操作的条件和层析柱清洁方法等。不同的吸附剂，可接受的操作条件是不同的，在使用之前应仔细阅读产品的销售文件。

3.原料/样品的准备

在样品上样于层析柱之前，必须采用高浓度盐的缓冲液提髙蛋白质混合物(将要采用HIC吸附剂纯化的样品）的盐浓度，目的在于使目标蛋白质能够与吸附剂结合。蛋白质在高盐浓度下可能发生沉淀，所以，在选择盐溶液之前,应先评估蛋白质复合物在给定盐溶液中的溶解性。缓冲液的PH对于蛋白质结合于HIC吸附剂的影响并不呈一般性的趋势,但是可以影响相互作用的强度（Hjertteetal.，1974)。选择缓冲液的pH,应该确保蛋白质和吸附剂在该环境下能够稳定(如避免使用极端PH溶液)。在调整蛋白质上样的步骤中，盐的浓度可以为〇.5〜2.0mol/L,并且可提髙浓度以确保蛋白质能够有效结合于吸附剂。蛋白质结合于吸附剂所需要的盐浓度在很大程度上取决于盐种类的选择，如3.2部分所述盐种类。在大多数情况下，选择蛋白质结合于吸附剂的适宜盐浓度需进行相关的预实验。

4.吸附剂的准备

在蛋白质原料上样前，应首先采用与原料相似组分(盐浓度）和Ph的高盐浓度缓冲液平衡层析柱，以确保蛋白质可以紧紧地结合于吸附剂上。该步骤称为平衡。

平衡结束之后，用合适的流速将调整后的原料(含有目标蛋白质）上样于HIC层析柱。完成上样后，通常用平衡缓冲液清洗层析柱，再洗脱目标蛋白质。洗脱前，额外的清洗步骤是为了去除不需要的蛋白质杂质。该清洗步骤所用的盐浓度处于中间水平—小于上样步骤时的盐浓度，但大于洗脱步骤的盐浓度。

5.产物洗脱

蛋白质结合于吸附剂上之后，必须再将目标蛋白质洗脱,并收集层析柱柱后的流出液。多数情况下，洗脱过程用于将不需要的蛋白质从目标蛋白质中分离或者去除。不需要的蛋白质可能与吸附剂结合的不是那么紧密,因而会先于目标蛋白质被洗脱。另外一些情况下，不需要的蛋白质会与吸附剂结合更加紧密，并会在目标蛋白质被洗脱之后仍与吸附剂结合。这种情况通常发生在HIC分离蛋白质多聚体时，目标蛋白质多聚体与吸附剂的结合比单体与吸附剂的结合更加紧密。在洗脱步骤中，流出液组分可能含有高纯度
产品,但在其之前或之后也会含有大量的不需要的蛋白质杂质。洗脱过程(梯度洗脱中)简图如图25.2所示。图25.2说明用HIC分离纯化时，在洗脱步骤中，应将柱后流出液进行等份收集，这样才可以获得适宜纯度的产品。在本章3.6节中，将会进一步详细描述梯度洗脱过程。

洗脱过程，可采用分步(等度)或梯度方式进行。4种最常见的洗脱结合蛋白质的方法(按照从最常见到最少见排列)如下所述。

(1)降低盐浓度(相对于结合条件)。盐浓度的降低会相应地减弱蛋白质和配基间的疏水作用，进而蛋白质被》吸附并从层析柱上洗脱下来。

⑵加入有机溶剂。有机溶剂(如乙烯或丙二醇)的加人可以改变溶液的极性,从而可以干扰疏水作用。

(3)提髙盐浓度(采用离液盐)。离液盐的加入可以干扰疏水作用。

(4)加人去污剂。去污剂可以用做蛋白质置换剂,主要用于HIC纯化膜蛋白(JansonandRyden,1997)

在洗脱步骤中，将蛋白质从HIC吸附剂上洗脱的最常用方法是降低盐浓度。用HIC纯化新的蛋白质组分时，同样首先采用该方法。上述其他方法的缺点在于，需要额外加人物质(如离液盐和有机溶剂），而这些物质可能影响蛋白质的稳定性。但是，洗脱与吸附剂结合比较紧密的蛋白质时，还是需要这些试剂的。每种蛋白质都必须逐个评价，以确定采用适宜的洗脱方法。纯化过程中所用的HIC吸附剂也可能影响洗脱方法的有效性。

6.梯度洗脱

蛋白质纯化中，梯度洗脱是一种用于筛选不同HIC吸附剂的十分有效方法。梯度洗脱时，盐的浓度以设定的体积，从高到低逐渐降低(线性方式)。初次筛选与蛋白质结合的吸附剂时，盐浓度甚至会降低至0mmol/L，以便于确定产品洗脱时的盐浓度。典型的梯度洗脱通常以10个柱体积洗脱缓冲液作为起始点，收集流出液组分并评价产品的纯度。降低盐浓度的梯度(进行较大体积的洗脱时)是为了提高蛋白质分离的分辨率(Yamam0-toetal.，1988)。梯度洗脱后，蛋白质仍处于与吸附剂结合的状态，表明应采用更弱的易溶盐使蛋白质与吸附剂结合或者选择更强的洗脱条件进行蛋白质洗脱。更强的洗脱条件包括使用有机溶剂。制备规模中，通常采用不易燃烧的有机溶剂（如丙烯或乙二醇)。分析规模所用的有机溶剂可能为乙腈和乙醇。同样，对于疏水结合能力较弱的吸附剂，可能需要相应地选择减弱疏水作用的强度。

7.分步(等度)洗脱

在确定合适的吸附剂及有效洗脱目标蛋白质的盐浓度后,如需要也可采用等度洗脱。采用等度洗脱的优点即为其简单性—只需要简单地转换输人缓冲液(从高到低的盐浓度)。如需简化对设备的要求,那么等度洗脱就是一种优选方法,而梯度洗脱则需要具有多个工作泵的设备,同时要求对缓冲液盐浓度的线性变化过程进行控制。

8.吸附剂的再生和清洁处理

多个循环的层析分离后，HIC吸附剂仍是可以重复使用的，且具有相对较长的使用期限。但是,吸附剂也必须进行清洁和再生处理，以确保经历多次循环使用后其性能仍可重现。吸附剂的供应商一般都会提供再生处理方法，在使用之前应仔细阅读。一般地，清洁规程取决于基础介质和疏水性配基的稳定性。对于结合能力强的蛋白质，通常推荐采用6mol/L盐酸胍。如之前的步骤中已使用去污剂,那么再生时采用乙醇或甲醇（GE
Healthcare,2006)。清洁处理时，腐蚀性的溶液（l.omol/LNaOH)可用于大多数的吸附剂(SiO2除外)。供应商同样还会提供适宜的储存条件信息。吸附剂储存溶液的选择应基于可防止微生物的生长，但同时又不会影响配基或基础介质的稳定性。