| 实验方法原理 | 将SDS-PAGE上的蛋白质样品从凝胶上分离出来是很困难的，目前流行的方法是将蛋白质电印迹（electrobloting）至PVDF膜上，直接进行序列分析或直接在膜上进行酶解，后者称为原位分析。 | ||||||||||
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| 实验材料 | 蛋白质样品 试剂、试剂盒 | PVP-40HAC酶解缓冲液蒸馏水 仪器、耗材 | Eppendoff管微量透析仪器或小凝胶过滤柱 实验步骤 | 1.蛋白质样品的准备 进行序列分析的蛋白质样品，一般纯度要求大于95％，通常是用色谱和电泳精制过的。 1.1SDS-PAGE纯化的样品 从SDS-PAGE上分离的蛋白质必须经过特殊处理，使SDS浓度低于0.0005％，否则SDS会影响到胰蛋白酶的酶解，也会明显降低HPLC分离时的分辨力。在SDS-PAGE后，采用电印迹（bloting）转移到PVDF膜上是常用的方法，因为PVDF膜结合蛋白质能力的专一性远远超过它与盐、氨基酸和去垢剂的结合，因此能将蛋白质与这些杂质分开。经过这样转移的PVDF膜可直接用于化学裂解或酶解后的肽段氨基酸序列分析。 1.2HPLC纯化的样品 如果样品是用反相HPLC纯化的。因为流动相是挥发性溶剂，在真空干燥或冻干样品时可被除去。如果蛋白质是用离子交换HPLC或疏水HPLC或凝胶过滤HPLC精制的，则样品要进行脱盐。 1.3蛋白质样品中的一硫键和疏基 在蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也已除净时，还要转变半胱氨酸残基或其他稳定的衍生物。因为半胱氨酸的巯基在分肽过程中易自动氧化成各种产物，包括形成无序的二硫键，因此需要将半胱氨酸残基先转变成稳定的衍生物。通常用碘代乙酸烷化，这个反应是快速和专一的；同时这类试剂保存在暗处是很稳定的。而且，这类试剂容易得到放射性标记物。蛋白质或肽在导入带电荷基团后也增加了它们在水溶液中的溶解度。 2.原位酶解和测序 2.1将膜片剪成1mm细条，放在Eppendoff管中； 2.2加1.2ml0.5％PVP-40／0.1mol／LHAC，37℃，保温30min； 2.3用蒸馏水洗膜5次以上，洗净残留的PVP-40； 2.4用酶解缓冲液漂洗，然后进行酶解； 2.5酶解：蛋白酶在100mol／LNH4HCO3：ACN＝95：5，pH8.2，37℃酶解过夜，对V8蛋白酶则在100mmol／L磷酸钠：ACN＝95：5，pH7.8，室温过夜。酶：底物1：10至1：20（W／W），对亚微克级样品，酶：底物高达2：1。酶解后-20℃保存或立即用几微升10％三氟乙酸（TFA）酸化，上样到HPLC柱上分析。如果蛋白质纯品的量足够多时，可采用常规的化学裂解或酶解方法得到可供进行氨基酸序列分析的肽段。 注意事项 | 1.磺代乙酸必须是无色的，有碘存在，呈淡黄色，会引起疏基迅速氧化，阻碍了烷化反应。 2.微克级蛋白质的操作，实验室内的温度，灰尘，纤维，皮肤汗液和头屑等都会影响结果。 3.容器及透析袋表面的吸附作用致使蛋白质严重损失。建议用微量透析仪器或小凝胶过滤柱脱盐。 其他 | |
