一、亲和树脂的制备

1.在固定缓冲液中，透析重组探针蛋白至少4h，换掉透析缓冲液，重复2次。

如果探针是经过HPLC纯化的合成肽，可以直接在固定缓冲液中进行。

要点：把蛋白质共价固定到NHS-琼脂糖凝胶前，彻底除去所有微量的胺和含巯基的试剂（如Tris-HCUDTT和谷胱甘肽）；否则，这些试剂会与树脂结合的NHS基团反应。TCEP是一种非亲核性还原剂，可以保持蛋白质的还原性，不会干扰后面的固定化学反应。

2.测量在280nm处的吸收值，确定透析蛋白质的浓度。

实验提示：用透析缓冲液作为分光光度计的空白对照（blank)。蛋白质的摩尔消光系数由方程nW(5690)+nY(1280)决定。其中nW和nY分别是融合蛋白中Trp和Tyr残基的数量。

3.室温下，用200fxl洗涤过的NHS活化的琼脂糖与6mg透析的蛋白质温育3h，并在旋转混合器中温和振荡。

同时，根据步骤③~⑤，用探针树脂制备对照树脂。如果探针蛋白已经是表达的融合蛋白，那么对照树脂应由固定到NHS琼脂糖上的融合标签（如GST)组成。否贝U，对照树脂只是经乙醇胺阻断的NHS-琼脂糖。

4.加0.1倍体积的lmol/L乙醇胺（pH8.0)，阻断任何未反应的NHS基团。室温下继续在旋转混合器中温和振荡3h或4°C过夜。

5.把树脂转移到一次性的IOml层析柱中，用50ml固定液洗涤树脂。

树脂可于4°C下，在含有0.02%(体积分数）叠氮化钠的固定缓冲液中保存。树脂的保质期取决于固定蛋白的稳定性。如果已知重组探针蛋白会快速降解，那么树脂应尽快使用。使用前，立即用裂解缓冲液洗涤亲和树脂（见第9章）。

二、相互作用蛋白质的纯化

6.收集IXlO9个培养细胞，用5ml冰冷的裂解缓冲液冰上裂解细胞30min。

对于悬浮培养的细胞，要得到上述要求的细胞数量应该是比较容易的。对于贴壁细胞，初始实验中可能要达到的细胞数量是IXlO8个。

7.把细胞裂解液转移到微量离心管中，4°C下最高速离心15min。

8.（可选择）把上清加到150ul预先用裂解缓冲液洗过的对照树脂中。在旋转混合器中4°C温育混合物2h，短暂离心，然后除去上清。

实验提示：这个预清除步骤用于减少与探针蛋白树脂非特异性结合的蛋白。开始尝试此方法时，最好不用进行这个步骤，但如果观察到背景蛋白污染的水平很髙，可以采用这个步骤。?

9.各取50ul树脂，加到不同的微量离心管中，用裂解缓冲液洗涤树脂几次，.每次洗涤后离心沉淀树脂。最后重悬树脂到最初的同样浓度，每份4u1，分装到新的管中。

10.把细胞裂解液分成两份，一半加到40ul探针蛋白树脂中，另一半加到4ul对照树脂中。在旋转混合器中4°C温育2h。

这些树脂适用于大多数需要，但要根据树脂上所载探针蛋白的密度进行调整。小蛋白或肽可较高密度地固定，这样可使用较少的树脂。相反，如果探针蛋白分子量较大，可能要用较多的树脂，所用树脂体积越大，背景蛋白污染的程度就越高。

11.短暂离心混合物，除去上清，用2ml冰冷的裂解缓冲液洗涤树脂，短暂离心，除去上清。重复洗涤步骤3次以上。

实验提示：洗涤的程度仅做参考。如必要，可根据对照树脂中捕获的背景蛋白的水平来增加或降低洗涤的程度。

12.加30ul2XSDS-PAGE凝胶上样缓冲液到每个树脂样品洗脱下来的结合蛋白中，95°C加热4min。

13.在4%~20%SDS-PAGE梯度凝胶中电泳样品（见第2章，方案1)。

14.考马斯亮蓝染色，显现蛋白条带（见第2章，方案2或方案3)。

如果考马斯染色看不到条带，重复实验，采用银染。注意，标准的银染方法（见第4章方案11和第7章方案11)不适用于原位消化和质谱分析。尽管适用于质谱的银染程序灵敏度低一些，但可考虑采用。见第2章方案7。

15.通过比较两块凝胶上的蛋白质总览，即由固定探针蛋白树脂和对照树脂捕获的裂解物中蛋白质。用干净的解剖刀切下探针蛋白树脂捕获的所有特异性条带，做后续的原位消化和质谱分析。