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【求助】有那位前辈用过clontech公司的SMART技术构建过cDNA文库
2021-07-31
问题描述:

我正在用clontech公司的SMART技术构建CDNA文库,我RNA提取用的TRIZOL,取的癌组织,标本离体后放冰盒,一小时后按比例加TRIZOL用剪刀剪碎,放-20过夜,其他步骤完全按说明进行.提的RNA跑胶还可以,ss-cDNA也还可以,可LD-PCR时就出不来.想请高手帮帮小弟.现附上电泳图.

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xiaoshuang
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我们曾做过cDNA文库构建,建议最好还是提mRNA来做比较可靠,总RNA中mRNA的比例很小,所以cDNA的量也可能少的多,而且还有rRNA的干扰
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kongsijin
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我的结果也和你一样,真不知道该怎么办了啊,现在我已经做了3次LD-PCR了,但是什么都没有,试剂盒的东西这么少,我该怎么办啊,请问你作出了吗,有什么好的建议吗
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biotce
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我也准备用这个做,不过还没有开始。想请教一下楼上的几位,你们第一链合成的时候做平行试验了么,不做可不可以啊,那个反转录酶只有5ul,这么一做就剩不多了。
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wutaoshunli
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建议直接交给公司做!ps:考虑清楚是不是有必要建库。
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wxg402
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可以试试Gateway技术建库
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tongjinlu490
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可是我们已经买了这种试剂盒,总要做下去吧?难道是试剂盒有问题,唉,clontech!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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阳光妩媚
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西安交通大学学报(医学版),编辑部邮箱2004年03期人正常肾组织全长CDNA文库的构建及鉴定
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wxg402
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首先我觉得RNA提的不是很好再次我觉得用mRNA比较好,试剂盒上也要求用mRNA吧,我们用的是taKaRA的试剂盒
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limin790313
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我也遇到跟楼主一样的问题,LDPCR后电泳什么都没有,真晕!就那么5微升的酶怎么敢随便折腾啊。试剂盒上好像是说提了mRNA用的是PrimerExtention法,提总RNA就是用LDPCR法。不知楼主后来是怎么解决问题的,盼赐教!
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zhsjwl
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我也买了,还没敢下手.请问一下过柱子时用的xylenecyanoldye在那买的谢谢
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shashababy
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......那是你们加的循环不够,我们作过引物延伸和长距离的,都比试剂盒指定的多了几倍.介意p40个循环.我们做了5次,都p出了东西.试剂盒应该没问题的
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RUILIANG131
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我买了CLONTECH公司的SUPER SMART试剂盒和消减试剂盒.其中也有LD PCR的过程,结果很好呀,22-23个循环的结果最好,我直接做了,也没有拿胎盘对照先试试,我觉得只能做7次,没舍得试,不过做了2次,结果都令人满意,可能是我刚买的盒子,没啥问题,建议买回来后分装,减少反复冻融的次数.
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bird19818
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楼上的请问下直接用RNA做好不好,或者有什么注意的问题呢?
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xuanmaochong
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直接做也可以,不过要注意说明书上按用RNA的操作说明做,没问题,你可以看看SMART的技术原理就明白了,祝你成功!
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maxif
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我们这里有个师兄是用的这个盒子建的
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zying1117
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我没用过clontech,我只做过stratagene的表达CDNA文库。但是建议你与厂家的售后服务联系一下,他们会给你找以下原因的。
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zying1117
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我没用过clontech,我只做过stratagene的表达CDNA文库。但是建议你与厂家的售后服务联系一下,他们会给你找以下原因的。
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zying1117
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我没用过clontech,我只做过stratagene的表达CDNA文库。但是建议你与厂家的售后服务联系一下,他们会给你找以下原因的。
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microxiaomei
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刚看到这个帖子,你这个库应该建的很成功吧,我现在是不知道要怎么来筛克隆,请指教一下!
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