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siRNA转染整理总结

2016-10-02

问题描述：

国庆节到了，给大家整理下园子内关于siRNA转染的资料。供刚开始进行转染的科研者使用。同时附上自己转染的经验。

第一部分

siRNA理论知识

siRNA转染讨论-蚂蚁淘论坛

细胞转染小技巧-蚂蚁淘论坛

回复：【求助】siRNA观念性问题-蚂蚁淘论坛

回复：【求助】siRNA基因敲除-蚂蚁淘论坛

回复：【求助】shRNA和siRNA的区别-蚂蚁淘论坛

回复：RNAishRNA和siRNA的区别是什么，两者分别用于什么时候？-蚂蚁淘论坛

关于这方面的理论知识去看看文献综述是个好办法。

第二部分

siRNA的设计

siRNA设计的原则-蚂蚁淘论坛

siRNA设计原则-蚂蚁淘论坛

回复：【共享】SiRNA序列的设计方法-蚂蚁淘论坛

请问siRNA和shRNA的设计有何区别？-蚂蚁淘论坛

第三部分

siRNA转染效率

FAM-siRNA转染效率检测-蚂蚁淘论坛

荧光显微镜检测细胞转染效率前是否需要换液-蚂蚁淘论坛

回复：siRNA效率-蚂蚁淘论坛

回复：【求助】为何siRNA转染效果不佳-蚂蚁淘论坛

回复：用lipo3000转染结直肠癌细胞dld-1，质粒DNA浓度偏低-蚂蚁淘论坛

关于siRNA转染效率的就推荐这5个帖子吧。有反馈结果的，都基本成功的帖子。外加第5个为质粒转染。

第四部分

siRNA动物体内转染

RNAi及siRNA转染相关实验技术答疑，有问题尽管提-蚂蚁淘论坛

回复：【求助】活体内的RNAi导入实验设计请教-蚂蚁淘论坛

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Shane_C

用户

转染率的测定只能靠荧光和PCR么，转染效率要达到多少才能符合一般实验要求有确切定论么？目前正在尝试联系文献作者进一步了解该环节的细节。其次我做RNAi准备用的是esiRNA，查资料好像比siRNA沉默率更高些。产品介绍中有详细esiRNA cDNA target sequence,而原蛋白编码基因尚无从获知。个人角度考虑怎样能保证esiRNA质量，怎样确保esiRNA有效可行？沉默率只能靠western和蛋白吸光度检测？沉默率达到多少能取得预期western结果（即证明蛋白表达差异有意义）？现如今主要是如何证明该方案的可行性并确保较高成功率，说服老板松口，真正开始进行实验。小白一只，摸石头过河，还望不吝赐教！

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小狐狸墨君

用户

想请问一下有没有使用了siRNA之后反而目的基因上调的情况，我们实验室最近有几例这种情况发生，不知道是哪里出了问题，是siRNA序列的问题吗？如果敲减不了应该是敲减效率不高，为什么反而会上调呢？

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东月来星

用户

下面进行自己的关于siRNA转染的想法。一首先是siRNA的设计关于siRNA设计最好的办法是交给公司免费设计，公司会根据你的目的基因序列设计针对靶序列的3条siRNA，能够保证的是3条siRNA里至少有一条效率是高的。我们只需要从3条siRNA序列里筛选出沉默效率最高的那条siRNA进行下游实验即可。也可以根据公司主页上的在线设计siRNA网站进行siRNA设计。这样的公司网站有很多。如Invitrogen公司https://rnaidesigner.Thermofisher.com/rnaiexpress/sort.doGenscript公司https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnaiSiDesignercenterhttp;//www.Dharmacon.com/1最后再次给大家介绍个比较好的siRNA设计网站。Sfold软件网址http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl界面如下图其设计siRNA主要根据靶的可接近性预测（targetaccessibilityevalution）一些经验规则和标准的设计规则，如AAAA，TTTT序列应避免，转录的终止信号。GGG，CCC序列应避免，能够形成四聚体并干扰RNAi等。一些热力学性质，RNA的二级结构的预测等。感兴趣的可以交流下。

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东月来星

用户

二。siRNA的转染效率1.转染效率的高低首先跟你的细胞的类型有很大的关系。这个帖子可以参考下细胞转染相关简述-蚂蚁淘论坛一般情况下，对于神经细胞和一些原代细胞加上悬浮细胞来说，其转染效率都是相对较低的。当然也有一些细胞系也是很难转的。所以对于想做转染的战友来说。在开始进行转染前需要明确的是你的细胞是否适合这种普通的转染方法，看看文献看看别人对于这种细胞都是采取的什么方法进行转染的。不行就要趁早使用电转或者考虑病毒转染，这些方法相对效率要高些。本人转染的原代血管内皮细胞。如果有想转染这类细胞的话可以交流下。2.转染试剂的选择，不推荐了。3好的细胞状态。如果细胞状态不行，细胞是不适合进行转染的。如果细胞状态不好的时候同时在使用脂质体转染试剂进行转染的时候，可能会加重转染试剂对于细胞的毒性作用。4.细胞的密度。不同的转染试剂所需要的细胞密度是不同的。请根据转染试剂上推荐的细胞铺板密度进行细胞铺板。5.SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化的。如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终溶度不要超过20nM吧，因为荧光信号被采集到需要一定的灵敏度的。所以一般推荐的siRNA终溶度多在50nM。关于siRNA的量与转染试剂的量进行优化，一般选择24孔板进行优化吧。比较节省各种试剂，一般对siRNA设计几个溶度梯度如50nM，80nM，100nM。转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动2个梯度。之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合从其中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。对于质粒转染也是一样的，比如质粒的量设计几个梯度如1ug,2ug等。进行组合即可。比值一般在1/2到1/8间进行优化吧。这个是很重要的。6用于稀释siRNA与转染试剂的无血清培养基。这里是推荐Thermo公司的opti-MEM培养基的。能够提高细胞的转染效率的，尤其是在进行脂质体转染的时候是会很大程度上较少细胞毒性作用。7.一般对于FAM标记的或者GFP等标记的siRNA转染。在转染后6h就可以确保siRNA转染进细胞了。因此一般在转染后6h即可进行转染效率的检测。方法有流式和荧光显微镜。8如果使用荧光显微镜观察的话，在观察之前需要使用PBS洗细胞3次，放在PBS里观察拍照。这样可以洗去黏在细胞表面的没有转染进去的siRNA，同时可以排除培养基颜色对于荧光的观察。9由于FAM荧光比较淡是没有GFP等荧光亮的，所以一般在显微镜下观察的时候我是喜欢将曝光调节到最大的。这样拍出来的荧光比较清楚。

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东月来星

用户

三。siRNA沉默效率的检测1.PCR检测mRNA水平的沉默效果，一般推荐在48h到72h检测吧。可能48h比较理想吧。需要具体的摸所时间。2.WB检测蛋白蛋白水平的检测，一般在转染后48h到92h间提蛋白检测蛋白水平的沉默效果，检测时间跟你的蛋白的半衰期有关系，具体的时间需要设计时间梯度，一般理想的是在72h最明显。3.PCR检测沉迷效果时，在设计引物的时候最好是将引物设计在沉默位点的两侧，而不是在同侧。这个是由于RNAi引起的沉默是先进行mRNA的切割之后造成mRNA的降解。这个可能切割和降解具有不同的时间点。即使不能设计在同侧，也不要离沉默位点太远的地方。不然可能会造成对沉默效果的低估。4.关于siRNA的阳性对照。如果你的实验中出现了siRNA的转染效率很高能够达到70以上，而siRNA的沉默效率始终很低的话，这个时候你需要怀疑你的siRNA的效果问题了。这个时候可以做下siRNA的阳性对照。阳性对照有actin和gapdh等。基本有针对这些基因的特异性的高效的siRNA序列。5.关于siRNA转染后多长时间加药的处理细胞的问题。siRNA干扰后多长时间可以加药处理？-蚂蚁淘论坛这篇帖子可以帮助你。一般都是采取转染后24h开始进行药物处理细胞，不过最后还是要看你的实验的目的的.四。siRNA体内转染目前正在养肿瘤细胞，还没有造模，等试验结果出来后再回来分享。五。有问题互相交流。

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东月来星

用户

终于没有敏感消息了

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cuishaohua

用户

感谢分享

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Bellayes

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非常感谢！一会儿就看看

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梦见宾

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非常感谢哦！

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Shane_C

用户

搜到一篇最近的文献，使用的是Lipofectamine™RNAiMAX转染原代小胶质细胞，我准备用现成的esiRNA配合该试剂转染，不知道成功率高不高，想用western检验。而且研究蛋白的esiRNA只有一种，没有参考文献应用，还不知道质量怎么样。导师就拿转染率低这个问题卡着，主要是怕我钱也花了不出成果，进行不了就得换题了，很是舍不得啊

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东月来星

用户

展开引用Shane_C搜到一篇最近的文献，使用的是Lipofectamine™RNAiMAX转染原代小胶质细胞，我准备用现成的esiRNA配合该试剂转染，不知道成功率高不高，想用western检验。而且研究蛋白的esiRNA只有一种，没有参考文献应用，还不知道质量怎么样。导师就拿转染率低这个问题卡着，主要是怕我钱也花了不出成果，进行不了就得换题了，很是舍不得啊......这个RNAiMAX是用来专门转染siRNA的转染试剂。质量上还是不错的，不过你的细胞的转染效率如何还得靠实验检测下。最后，你的目的siRNA只有一条，所以在进行western检测蛋白的沉默效果时首先去确保你的siRNA的转染效率。如果转染效率不行，下面也没法进行。所以先试试吧，根据说明书先做转染效率的检测。至少保证你的细胞能够成功转染上siRNA，并且转染效率是高的才有意义。

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Shane_C

用户

转染率的测定只能靠荧光和PCR么，转染效率要达到多少才能符合一般实验要求有确切定论么？目前正在尝试联系文献作者进一步了解该环节的细节。其次我做RNAi准备用的是esiRNA，查资料好像比siRNA沉默率更高些。产品介绍中有详细esiRNACDNAtargetsequence,而原蛋白编码基因尚无从获知。个人角度考虑怎样能保证esiRNA质量，怎样确保esiRNA有效可行？沉默率只能靠western和蛋白吸光度检测？沉默率达到多少能取得预期western结果（即证明蛋白表达差异有意义）？现如今主要是如何证明该方案的可行性并确保较高成功率，说服老板松口，真正开始进行实验。小白一只，摸石头过河，还望不吝赐教！

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东月来星

用户

展开引用Shane_C转染率的测定只能靠荧光和PCR么，转染效率要达到多少才能符合一般实验要求有确切定论么？目前正在尝试联系文献作者进一步了解该环节的细节。其次我做RNAi准备用的是esiRNA，查资料好像比siRNA沉默率更高些。产品介绍中有详细esiRNACDNAtargetsequence,而原蛋白编码基因尚无从获知。个人角度考虑怎样能保证esiRNA质量，怎样确保esiRNA有效可行？沉默率只能靠western和蛋白吸光度检测？沉默率达到多少能取得预期western结果（即证明蛋白表达差异有意义）？现如今主要是如何证明该方案的可行性并确保较高成功率，说服老板松口，真正开始进行实验。小白一只，摸石头过河，还望不吝赐教！......1.关于这个转染效率的测定，前面已经说的很清楚了。PCR是检测的沉默效果，跟western一样，一个检测mRNA的一个检测蛋白的而已。所以关于转染效率的检测还是靠荧光吧，方法有荧光显微镜检查，也有流式检查。70%以上的转染效率是好的。2.esiRNA就是相当于几条siRNA的混合物吧，具有好几个干扰位点，因此它的沉默效果相比较于siRNA来说效果会更好点。脱靶效应也会低些。要想确保你的esiRNA的效果还是靠PCR或者WB检测沉默效果。沉默效果至少达到50%吧。3.可以在实验开始前，转染试剂是要少买点的。一般公司都有试用装，可以要点少量试用装回来尝试先。如有需要可以私信几个转染试剂。

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随风-逝

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好帖子，收藏

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六道神仙哥

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谢谢分享

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榛子曲奇

用户

谢谢楼主分享。我也是刚开始做转染，想问一下如果用流式测FAM信号，是不是直接用PBS洗一下就可以上机了呢？谢谢！

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zoe戴戴

用户

请问各位大神，siRNA体内转染局部组织注射的浓度怎么确定呢？需要与engreen的体内转染试剂混合后再注射吗？

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东月来星

用户

榛子曲奇谢谢楼主分享。我也是刚开始做转染，想问一下如果用流式测FAM信号，是不是直接用PBS洗一下就可以上机了呢？谢谢！是的。如果是siRNA转染后6h就可以进行检测了。

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东月来星

用户

zoe戴戴请问各位大神，siRNA体内转染局部组织注射的浓度怎么确定呢？需要与engreen的体内转染试剂混合后再注射吗？这个，你的局部注射是注射啥组织？皮下肿瘤？一般对于siRNA的体内给药最好的还是别尝试单独裸注射siRNA吧。效果不好。能借助转染试剂的还是借助下吧。对于不同的组织的给药量是不一样的。engreen的体内转染试剂说实话价格可以但是经不住用量大啊。而且动物实验分组又多如果想做长期还得连续给药。下图是不同的组织的给药量。附件为engreen的体内转染试剂的说明书。可以参考吧。最近也在做皮下肿瘤模型的siRNA体内转染。目前进行到一半了吧。之前养了一批老鼠被猫吃了耽误了好久。Entranster－inVivo-RNA(CN)2014-12-10.pdf(176.71k)

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zoe戴戴

用户

展开引用东月来星zoe戴戴请问各位大神，siRNA体内转染局部组织注射的浓度怎么确定呢？需要与engreen的体内转染试剂混合后再注射吗？这个，你的局部注射是注射啥组织？皮下肿瘤？一般对于siRNA的体内给药最好的还是别尝试单独裸注射siRNA吧。效果不好。能借助转染试剂的还是借助下吧。对于不同的组织的给药量是不一样的。engreen的体内转染试剂说实话价格可以但是经不住用量大啊。而且动物实验分组又多如果想做长期还得连续给药。下图是不同的组织的给药量。附件为engreen的体内转染试剂的说明书。可以参考吧。最近也在做皮下肿瘤模型的siRNA体内转染。目前进行到一半了吧。之前养了一批老鼠被猫吃了耽误了好久。......非常感谢！！！我是打结膜下注射，注射在眼球结膜下使其慢慢渗透至角膜，要求干扰的时间比较短，7d之内就结束观察。您做的皮下肿瘤模型运用了哪种转染试剂吖，方便交流一下吗？谢谢谢谢谢

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东月来星

用户

展开引用zoe戴戴东月来星zoe戴戴请问各位大神，siRNA体内转染局部组织注射的浓度怎么确定呢？需要与engreen的体内转染试剂混合后再注射吗？这个，你的局部注射是注射啥组织？皮下肿瘤？一般对于siRNA的体内给药最好的还是别尝试单独裸注射siRNA吧。效果不好。能借助转染试剂的还是借助下吧。对于不同的组织的给药量是不一样的。engreen的体内转染试剂说实话价格可以但是经不住用量大啊。而且动物实验分组又多如果想做长期还得连续给药。下图是不同的组织的给药量。附件为engreen的体内转染试剂的说明书。可以参考吧。最近也在做皮下肿瘤模型的siRNA体内转染。目前进行到一半了吧。之前养了一批老鼠被猫吃了耽误了好久。非常感谢！！！我是打结膜下注射，注射在眼球结膜下使其慢慢渗透至角膜，要求干扰的时间比较短，7d之内就结束观察。您做的皮下肿瘤模型运用了哪种转染试剂吖，方便交流一下吗？谢谢谢谢谢......用的就是这个engreen的。7天结束的话，想效果好可以7天里注射2次。具体的这个剂量你可以问问他们的客服。大概在一个范围内吧。InhibitionofOcularAngiogenesisbysiRNATargetingVascularEndothelialGrowthFactorPathwayGenes这个是之前看到的一个文献，就是往球结膜内注射siRNA的。他做的大概一只眼球打了10ug的siRNA。在打之前最好问下公司的技术支持吧。加油。InhibitionofOcularAngiogenesisbysiRNATargetingVascularEndothelialGrowthFactorPathwayGenes.pdf(1087.16k)

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zoe戴戴

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展开引用东月来星用的就是这个engreen的。7天结束的话，想效果好可以7天里注射2次。具体的这个剂量你可以问问他们的客服。大概在一个范围内吧。InhibitionofOcularAngiogenesisbysiRNATargetingVascularEndothelialGrowthFactorPathwayGenes这个是之前看到的一个文献，就是往球结膜内注射siRNA的。他做的大概一只眼球打了10ug的siRNA。在打之前最好问下公司的技术支持吧。加油。......太棒了，这是我这么久在论坛获得的回复最有帮助的一次~~再次感谢楼主大大

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小狐狸墨君

用户

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东月来星

用户

小狐狸墨君想请问一下有没有使用了siRNA之后反而目的基因上调的情况，我们实验室最近有几例这种情况发生，不知道是哪里出了问题，是siRNA序列的问题吗？如果敲减不了应该是敲减效率不高，为什么反而会上调呢？这个siRNA不起沉默效果却使得目的基因表达水平升高。这个是个挺有意思的现象。之前也看到过一篇帖子讲这个的，还有篇nature的文章支持。首先，先排除下调控机制外的一些可能因素吧。比如第一，你的转染试剂组的基因表达水平如何，是否是转染试剂造成了目的基因的表达水平的上移。这个得先搞清楚。第二个就是你的检测沉默效果的方法是通过什么手段进行检测的。是PCR还是WB。或者是在基因水平和蛋白水平都造成了表达水平的升高？还是？如果做PCR的话还是做荧光定量的比较有参考意义吧。最后还得看下蛋白的表达水平。在者就是生命机体的调控机制了。比如内源性的miRNA参与了补偿调节等。之前看到的一篇帖子。附上来。作者做了很多没接触过的技术，感兴趣看看。siRNA/miRNA转染:目的基因为何不降反升？-蚂蚁淘论坛最后实验在重复看看，排除其他的一些实验误差吧。

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东月来星

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敏感信息真是讨厌。无力吐槽。

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东月来星

用户

这个siRNA不起沉默效果却使得目的基因表达水平升高。这个是个挺有意思的现象。之前也看到过一篇帖子讲这个的，还有篇文章支持。首先，先排除下调控机制外的一些可能因素吧。比如第一，你的转染试剂组的基因表达水平如何，是否是转染试剂造成了目的基因的表达水平的上移。这个得先搞清楚。第二个就是你的检测沉默效果的方法是通过什么手段进行检测的。是PCR还是WB。或者是在基因水平和蛋白水平都造成了表达水平的升高？还是？如果做PCR的话还是做荧光定量的比较有参考意义吧。最后还得看下蛋白的表达水平。在者就是生命机体的调控机制了。比如内源性的miRNA参与了补偿调节等。之前看到的一篇帖子。附上来。作者做了很多没接触过的技术，感兴趣看看。@小狐狸墨君

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东月来星

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siRNA/miRNA转染:目的基因为何不降反升？-蚂蚁淘论坛

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东月来星

用户

蚂蚁淘哪里这么多的敏感信息。

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初见嘎嘎

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我的情况和小狐狸墨君的类似，也是siRNA转染后RT-PCR检测目的基因MRNA水平不降低反而升高了！我想问下我这种情况是siRNA是否转染进去了？如果转染进去了，我用了别人的荧光标记的control质粒转染我的细胞时，却没有观察到荧光。可是如果没有转染进去的话，RT-PCR检测目的基因不是应该不变的吗？为什么是高了呢？求大神们不吝赐教，不胜感激！

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东月来星

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展开引用初见嘎嘎我的情况和小狐狸墨君的类似，也是siRNA转染后RT-PCR检测目的基因MRNA水平不降低反而升高了！我想问下我这种情况是siRNA是否转染进去了？如果转染进去了，我用了别人的荧光标记的control质粒转染我的细胞时，却没有观察到荧光。可是如果没有转染进去的话，RT-PCR检测目的基因不是应该不变的吗？为什么是高了呢？求大神们不吝赐教，不胜感激！......这个前面的说了。你得先保证你的siRNA是转染成功的。既然能用别人的荧光标记的control质粒转染。自己也可以搞一个带荧光的controlsiRNA转染。观察荧光。这个很便宜的。一般买siRNA都会附送的。而且转染质粒跟siRNA条件还是有差异的。不知道有没有进行一个比例摸索。既然做的是siRNA就转染带荧光的siRNA吧。siRNA跟质粒的bp长度还是不一样的，他们的转染条件也是不适用的。先解决转染效率在去解决基因沉默效果吧。如果做PCR建议做定量的。最后还是看蛋白水平的表达。至于原因看上面的吧一个个排除下

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初见嘎嘎

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谢谢楼主解惑。因为我的controlsiRNA是不带荧光的。认识的同学的siRNA也是不带荧光标记的。所以想问下看转染效率的话除了看荧光，还有没有其他方法可以看转染效率？

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东月来星

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初见嘎嘎谢谢楼主解惑。因为我的controlsiRNA是不带荧光的。认识的同学的siRNA也是不带荧光标记的。所以想问下看转染效率的话除了看荧光，还有没有其他方法可以看转染效率？没有。公司买就可以了。一个OD就够了。

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初见嘎嘎

用户

东月来星没有。公司买就可以了。一个OD就够了。有一个疑问，如果借别人的controlsiRNA用的话（我们的目的不一样），有荧光的话，能证明我的siRNA转染是成功的吗？如果没有荧光，能证明我的siRNA转染就是失败的吗？

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东月来星

用户

展开引用初见嘎嘎东月来星没有。公司买就可以了。一个OD就够了。有一个疑问，如果借别人的controlsiRNA用的话（我们的目的不一样），有荧光的话，能证明我的siRNA转染是成功的吗？如果没有荧光，能证明我的siRNA转染就是失败的吗？......是的。实际上只要siRNA带有荧光就可以进行检测了。记得借也要借带有荧光的siRNA。siRNA长度是一样的，你只是判断有没有转染进去siRNA，所以跟你的目的siRNA没有关系。转染进去了，就能观察到荧光，观察不到就是转染失败。因为siRNA不能做稳转，所以要保证你的siRNA的转染效率足够的高。

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阿富汗猛男

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楼主您好，请问“皮下肿瘤模型的siRNA体内转染”您有没有什么经验分享呀？

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阿富汗猛男

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楼主您好，看了其他帖子有用lipo2000载体的有用PEI载体的有稀释在生理盐水的；有腹腔注射的有尾静脉注射的有瘤内注射的，请问楼主有什么建议吗?谢谢楼主

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