•PCR反应的成分和作用总体积：一般为25μl～100μl（一）无Mg2buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。（二）Mg2:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200μmol/L，注意Mg2与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2能影响反应的特异性和产率。（三）BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。（五）Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。（七）引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。引物GC约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。 •PCR反应条件的选择（影响因素）•温度参数：1.变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。2.退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(GC)×4℃(AT)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(GC)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。 •PCR扩增仪
