寡核苷酸探针原位杂交操作流程细胞爬片
一、材料准备：
1.细胞爬片:细胞爬片经固定液-4%多聚甲醛/0.1MPBS（PH7.0-7.6），含有1/1000DEPC，固定15min。经无水乙醇、95%、85%和75%乙醇各2min脱水。
2.探针:多聚寡核苷酸探针-FITC 2ug/ml
二、FISH操作流程
- 暴露mRNA核酸片段：细胞爬片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃消化5分钟。
- 原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
- 无水乙醇、95%、85%和75%乙醇各2min脱水。
- 预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20-30%甲酰胺150ml以保持湿度。按每张爬片滴加20μl预杂交液。恒温箱37℃ 2小时。吸取多余液体，不洗。
- 杂交:按每张切片20μι杂交液(内含寡核苷酸探针-FITC,2.0ug/ml)，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。如检测细胞爬片内的DNA需85-95℃变性6-8min；如检测细胞爬片内的RNA则无需变性。
- 恒温箱37℃杂交过夜(16h)。
- 杂交后洗涤:揭掉盖玻片，37℃水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次;37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次。或75℃,0.3XSSC洗5-8min。
- PBS洗2*3min。
- 用内含0.001%DAPI缓中甘油封片,-20℃保存备用。
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发布于 ： 2021-07-19
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