随机引物法（在融化琼脂糖存在下利用随机寡核苷酸延伸进行DNA的放射标记）
| 实验方法原理 | 此法系可用于从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA的放射性标记(Feinberg和Vogelstein1983，1984)。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段模板DNA 试剂、试剂盒 | 醋酸氨牛血清白蛋白乙醇溴化乙啶NA终止贮存缓冲液随机引物缓冲液 仪器、耗材 | 碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶沸水浴SephadexG-50离心柱 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 醋酸氨（10mol/L) 牛血清白蛋白（10mg/ml) 乙醇 溴化乙啶（10mg/ml）或SYBRGold染液 NA终止/贮存缓冲液（50mmol/LTris-Cl(pH7.5)，50mmol/LNaCl，5mmol/LEDTA(pH8.0)，0.5%(m/V)SDS） 5X随机引物缓冲液（250mmol/LTris(pH8.0)，25mmol/LMgCl2，20mmol/LDTT，未标记的dNTP各2mmol/L，1mol/LHEPES(用4mol/LNaOH调至pH6.6），1mg/ml长度为6个碱基的随机脱氧寡核苷酸引物） 2.酶和缓冲液 大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段 3.凝胶 碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶 4.核酸和寡核苷酸 长度为6或7个碱基的随机脱氧核苷酸引物（125ng/μlTE，pH7.6) 模板DNA 5.放射性复合物 [α-32P]dNTP(10mCi/ml，比活性>3000Ci/mmol） 6.专用设备 沸水浴 SephadexG-50离心柱，用TE(pH7.6)平衡 二、方法 1.电泳后用溴化乙锭（终浓度0.5μg/ml）或SYBRGold染胶，切下所需条带，尽可能切去多余的凝胶。 2.将切下的条带放入预先称过重量的微量离心管中，称出带的重量。每克琼脂糖凝胶加水3ml。 3.将微量离心管放在沸水浴中煮7min以使凝胶融化，同时也使DNA变性。 如立即进行标记，可将离心管置于37℃，直至需要加入模板；否则可贮存于-20℃。但每次从-20℃取出后，含DNA的凝胶团要在100℃加热3~5min，然后置于37℃直至放射性标记反应开始。 4.将一个新的微量离心管置于37℃水浴或加热板上，按下列次序加入： 5X寡核苷酸标记缓冲液 10μl 10mg/ml牛血清白蛋白溶液 2μl DNA(体积不超过32μl） 20~50ng 10mCi/ml[α-32P]dNTP 5μl (比活性>3000Ci/mmol） Klenow片段（5单位） 1μl 水 加至50μl 用微量加样器彻底混合各组分，于室温温育2~3h或37℃温育60min。 5.在反应液中加入10μlNA终止/贮存缓冲液，可根据需要进行以下步骤。 贮存放射性标记的探针于-20℃以备杂交用。 或 通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的dNTP或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的DNA。如果>50%的放射性dNTP已在反应中掺入，可不进行该步骤。    |
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发布于 ： 2021-08-08
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