通过超滤去除DNA扩增产物中的寡核苷酸及过剩dNTP
| 实验方法原理 | PCR反应结束后，从扩增DNA产物中去除扩增反应残余下来的寡核苷酸引物，引物二聚体及dNTP是非常必要的。首先，DNA扩增目的产物内残余的dNTP可以在剩余热稳定DNA聚合酶的作用下填平已被限制性内切核酸酶切割产生的DNA产物的黏末端，使后者难以被进一步克隆。其次，过量的寡核苷酸引物可导致用第一次PCR扩增的DNA产物作模板再进行第二次PCR扩增反应的效率降低。最后，引物二聚体内部的众多的限制性核酸内切酶酶切位点可与扩增DNA片段两末端的酶切位点竞争限制性核酸内切酶，从而影响扩增DNA片段的薄切效率。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 扩增反应产物 试剂、试剂盒 | 氯仿乙醇乙酸钠TE 仪器、耗材 | 制备性离心机或小型离心机浓缩器 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 氯仿 乙醇 乙酸钠（3mol/L) TE(pH8.0) 2.核酸和寡核苷酸 扩增反应产物（20~200μl) 3.离心机和转头 制备性离心机或小型离心机 4.特殊设备 浓缩器（Centricon-100orMicrocon-100，Amicon) 二、方法 1.放置2mlTE(pH8.0)在Cemricon-100浓缩器的贮液腔内。用移液器小心地从上层矿物油下面抽取扩增反应产物，或者用氯仿抽提反应管内的样品。 2.放置转移扩增反应产物到Centricon-100浓缩器的贮液腔内。浓缩装置至制备性离心机的合适转头上（如固定直角转头)。将这种微量浓缩器用一只过滤杯插入离心机上，过滤杯的半透明部分朝向转头的底部。使用另一只充满等量液体的浓缩器或标准平衡管作为相对应的平衡物。 3.上样后的浓缩器用1000g离心力离心30min，温度在4℃至25℃。 4.把浓缩器从离心机上卸下，弃半透明过滤杯中的液体，转换浓缩器，放回到离心机上（即现在浓缩潲留液管的放置应该朝向转头的底部)。再用300~1000g离心2min。 5.把浓缩器从离心机上卸下；取出浓缩潴留液，弃浓缩器装置内的残余液体。转移浓缩潴留液管内的浓缩液到一只新的离心管内。 6.如果必要，可用1/10倍体积的3mol/L乙酸钠和2~3倍体积的乙醇沉淀浓缩潴留液管内的样品。这种经离心透析得到的样品可用于后续进一步操作（如DNA测序和连接反应)。应用Centricon-100滤膜浓缩器进行一步离心透析，可去除PCR扩增DNA样品中95%的残余引物和寡核苷酸，同时这个透析过程也能使热稳定DNA聚合酶失活（可能是滤膜吸附作用引起的）。通常单独一步纯化即可满足扩增DNA后续的分子操作要求。如果必要，痕迹量的寡核苷酸引物可用第二轮的30min离心透析步骤予以去除。在上述步骤4，倒空半透明过滤杯中的液体，重新装配浓缩器，另加2mlTE(pH8.0)至贮液腔中，重复步骤2至4。 较小规模快速纯化扩增产物也能应用Cemricoti-100滤膜浓缩器。总的操作步骤是与Centricon-100浓缩器相类似的，除了在步骤1，加入贮液腔内400μlTE，接着加入PCR扩增样品20~100μl。 在一台变速离心机上用3000g进行5~7min离心。将滤出液去除，浓缩液样品转移至潴留液杯内，继续用300-1000g离心1min。这个操作过程可去除约90%的寡核苷酸引物和脱氧核苷酸，如重复上述过程可进一步纯化扩增的DNA样品。 |
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发布于 ： 2021-09-22
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