细胞培养对无菌环境的要求较为严格。细胞培养间的杀菌主要涉及空气的杀菌，其常见的四种方法如下：
1、甲醛熏蒸
甲醛是一种高效能化学灭菌剂。不易燃、不爆炸、不腐蚀金属。它能与蛋白质中的氨基酸结合而使蛋白变性，使酶的活性消失。故有强大的杀菌作用。一般称作为“大消”，用来对细胞间进行彻底的消毒杀菌。但是甲醛是一种对人体有害的物质，并且细胞培养实验室一般空气流通都很差，甲醛的排出也很慢，至少要一周以上。如果要紧急使用的话，在甲醛灭菌完后，可以用等量的氨水中和空气中的甲醛。
2、空气过滤（恒温恒湿装置）
这是一种最安全，杀毒效果也最好的方法，只是费用较为昂贵。衡量空气洁净度的级别标准如下表1。
表1洁净室（区）空气洁净度级别表
洁净度级别尘粒最大允许数/立方米微生物最大允许数/立方米浮游菌/立方米沉降菌/皿
100级3500051
10000级35000020001003
100000级35000002000050010
300000级1035000060000-15
3、紫外线灯杀菌
紫外线灭菌是用紫外线管照射进行的。波长在220-300nm的紫外线称为“杀生命区”，其中以260nm的杀菌力最强。紫外线作用于细胞DNA，使DNA链上相邻的嘧啶碱形成嘧啶二聚体（如胸腺嘧啶二聚体），抑制了DNA复制。另外，空气在紫外线照射下可以产生臭氧，臭氧也有一定的杀菌作用。紫外线透过物质的能力很差，适用于空气及物体表面的灭菌，与被照物的距离以不超过1.2m为易，照射时间以紫外线灯管的功率大小、被照空间及面积大小，根据灭菌效果测定结果而定。由于上述各种情况的不确定性，导致紫外线杀菌效果不是很理想，一般需要过夜杀菌。此外紫外线对人体有伤害作用，不要在紫外线灯照射下进行操作。
4、电子消毒灭菌器杀菌
即臭氧灭菌。在高压电场作用下，电子管的内外电极发生强烈电子轰击，使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气（O2）和单个氧原子（O）；后者具有很强的活性，能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应，从而靠氧原子的弥漫性扩散达到杀菌之目的，消毒时没有死角。消毒后空间的残留的多余氧原子只需30～40min则会自行重新结合成为普通氧原子（O2），不存在任何有毒残留物，故称无污染消毒剂，它不但对各种细菌（包括肝炎病毒，大肠杆菌，绿浓杆菌及杂菌等）有极强的杀灭能力，而且对杀死霉素也很有效。
此外，细胞培养间的地板也应定期使用新洁尔灭进行消毒灭菌，并打扫干净；培养箱、桌面定期用75%的酒精进行擦拭消毒，防止污染。
