ChIP实验中,抗体的质量直接影响实验的结果
那么如何在ChIP实验中选择最适合的抗体也能也是实验最关键的一步
很多老师在ChIP实验中最关心两个问题:
一、
在已有的ChIP级别抗体中,如何选择最高特异性的ChIP抗体,虽然很多厂家都能够提供ChIP级别抗体,但是在2011年的一篇Nature文献报道中显示即使ChIP级别的抗体,结合特异性也只有70%左右,我如何选择高特异性的ChIP级别抗体?
ChIP实验中抗体的选择是实验成功的核心要素。在2011年NatStructMolBiol[1,2]报道中通过斑点杂交和ChIP-chip试验显示,分别只有73%和78%的抗体具有较好特异性(图1,图2)。作者进一步通过WB检测3个品牌表观抗体的特异性,仅有一个品牌(Millipore)抗体通过特异性检测(图3),另外两品牌抗体未通过特异性结合实验。
(a) Westernblotofanti-H3K4me2(Millipore,07-030,lotDAM1543701),anti-H3S10ph(Wako,303-35199),andanti-H4K20me3(Diagenode,CS-057,lotA9-002).
针对这种情况给大家推荐一个非常好的方法,通过全球最大抗体查询网站CiteAb(http://www.citeab.com/)进行查询,能够获得每个ChIP抗体的文献引用次数(CiteAb显示Merck旗下多种表观遗传抗体全球使用率排名第一)
二、
ChIP实验中需要选择ChIP级别抗体,没有ChIP级别抗体该怎么选择?如果我的实验种属比较特殊(果蝇,昆虫,植物等)该怎么选择ChIP实验抗体?
但是由于ChIP级别(ChIP验证)过的抗体数量非常有限,所以当没有ChIP级别抗体时,我们有如下3种方法可以考虑:
1
选择IP/IHC/ICC进行尝试,一般在这些实验中抗体对蛋白的识别结构是native,和ChIP抗体识别结构较为相似;不建议尝试Westernblot抗体,因为WB抗体识别的蛋白结构多是denature,并不适合ChIP实验;
2
将蛋白的序列放在NCBI上进行Blast,如果蛋白序列同源性与其他种属或物种蛋白超过80%,可以尝试跨物种抗体;
3
可以使用标签抗体,但是标签页可能干扰转录因子并可能引入假阳性相互作用,因此需要设置好对照,包括未转染细胞的mockIP对照;以及将标签从N端转换到C端作为对照。
温馨提示
如果您的实验种属非常特殊(果蝇,拟南芥等),默克(Merck)公司技术服务部门(400-899-1988-2-2),能免费提供高质量的比对服务,针对不同种属的ChIP抗体,验证成功率在90%以上。
Upstate(Merck子品牌):
表观遗传及信号通路研究领跑者
1990,推出全球首款ChIP试剂盒(>50000篇文献引用);
2009,推出全球首款RIP试剂盒(>7000篇文献引用);
2010,全球20000篇文献使用Merck表观抗体;
2010,推出全球首款EZ-ChIP试剂盒;
2014, 推出全球首款NuclearRIP试剂盒;
2014,推出全球首款最高灵敏度ChIP试剂盒
2015, 推出全球首款ChIRP试剂盒