Tauproteinsaremicrotubule-associatedprotein(MAPs)whichareabundantinneuronsofthecentralnervoussystem,butarealsoexpressedatverylowlevelsinCNSastrocytesandoligodendrocytesandelsewhere.Oneoftau"smainfunctionsistomodulatethestABIlityofaxonalmicrotubules.Tauisactiveprimarilyinthedistalportionsofaxonsprovidingmicrotubulestabilizationaswellasflexibility.PathologiesanddementiasofthenervoussystemsuchasAlzheimer"sdiseasefeaturetauproteinsthathavebecomedefectiveandnolongerstabilizemicrotubulesproperly.Asaresult,tauformsaggregateswithspecificstructuralpropertiesreferredtoasPairedHelicalFilaments(PHFs)thatareacharacteristicofmanydifferenttypesofdementias,knownastauopathies.Tauhastwoprimarywaysofcontrollingmicrotubulestability:isoformsandphosphorylation.Sixtauisoformsexistinhumanbraintissue,andtheyaredistinguishedbythenumberofbindingdomains.Threeisoformshavethreebindingdomainsandtheremainingthreehavefourbindingdomains.Thebindingdomainsarelocatedinthecarboxy-terminusoftheproteinandarepositively-charged(forbindingtothenegatively-chargedmicrotubule).Tauisoformswithfourbindingdomainsarebetteratstabilizingmicrotubulesthanthosewiththreebindingdomains.Thus,inthehumanbrain,thetauproteinsconstituteafamilyofsixisoformswiththerangefrom352-441aminoacids.Theyalsodifferineitherzero,oneortwoinsertsof29aminoacidsattheN-terminalpart(exon2and3),andthreeorfourrepeat-bindingregionsattheC-terminus.So,thelongestisoformintheCNShasfourrepeats(R1,R2,R3andR4)andtwoinserts(441aminoacidstotal),whiletheshortestisoformhasthreerepeats(R1,R3andR4)andnoinsert(352aminoacidstotal).Tauisalsoaphosphoproteinwith79potentialSerine(Ser)andThreonine(Thr)phosphorylationsitesonthelongesttauisoform.Phosphorylationhasbeenreportedonapproximately30ofthesesitesinnormaltauproteins.MechanismsthatdrivetaulesionformationinthehighlyprevalentsporADIcformofADarenotfullyunderstood,butappeartoinvolveabnormalpost-translationalmodifications(PTMs)thatinfluencetaufunction,stability,andaggregationpropensity.
ProductDetailsebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot。因为WesternBlot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然,顺利的时候WesternBlot做起来很简单,可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟,作为一种有活性的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定性的。所以,严谨的WesternBlot实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时,借助参照体系很容易就可以查出问题所在,而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小),空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照),已知量标准产物的正对照;另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因,国内的不少人做Western Blot往往省略参照,导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。
内参是最容易被忽略的一项。我们知道,要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少,前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础。特别表达量不高时,上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。
内参即是内部参照(InternalControl),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(HousekeepingProteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。
在国外发表的文章中,Western Blotting实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是,国内仍有不少科研人员在WesternBlotting实验中忽略了内参的使用,将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法,都存在局限性,不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质,相对于比色法来说,操作简单,但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;且敏感度低,要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA,Bradford,Lowry等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高,且与一系列干扰Lowry,BCA反应的还原剂(如DTT,巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的,其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性。另外,蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样,此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参,即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
在WesternBlotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
实验结果分析其实很简单:如果样品蛋白量有限,只够进行一次电泳转膜实验时,分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量,得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量,再用此数值进行样品间的比较和分析,得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分,可以先检测内参,观测样品间内参显色条带是否一致,根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验,至内参量一致为止;若内参一致,即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点,但是可以保证结果更有说服力,更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。
附:在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有:
一、 超级简便的标记内参使用法:只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体,按照正常操作即可。
二、普通内参:当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时,可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体,重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下,可以在转膜后预染,根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分,使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育,二抗温育以及显色。
【摘自网络】展开
一.样本种属来源:
首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。
1、哺乳动物的组织或者细胞样本,通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atpase等。
2、植物来源实验样本,则可以选择plantactin、Rubisco等。
3、其他来源样本研究较少,所以就应该参照文献报导,选择合适的蛋白作为内参。
二.目的蛋白分子量:
选择内参抗体时,应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量为45KD,此时不适宜选择β-actin作为内参,可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。
三.目的蛋白表达部位:
就一般的蛋白检测来说,β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了,而针对于核蛋白的定量,特别是样本蛋白就是核蛋白时,选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3,除此之外,其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等,在一些文献报道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测,常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测,常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。
以上几条原则只是针对通常情况,但是需要注意的问题是——内参的选择需要考虑实际的试验环境,比如某些细胞中,由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高,不适合做内参。比如在涉及细胞增殖相关试验中,c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参;而在凋亡实验时,TBP、Lamin等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献,在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常,应考虑这方面因素。
内参抗体:
Beta-Actin mAb (1C7) 细胞总蛋白 42 kD Abbkine A01010 小鼠源单克隆
Beta-Actin mAb (1C7) , HRP 细胞总蛋白 42 kD Abbkine A01015 小鼠源单克隆,HRP偶联
GAPDH mAb (2B5) 细胞总蛋白 36 kD Abbkine A01020 小鼠源单克隆
GAPDH mAb (2B5) , HRP 细胞总蛋白 36 kD Abbkine A01025 小鼠源单克隆,HRP偶联
Beta-Tubuline mAb (3G6) 细胞总蛋白 55 kD Abbkine A01030 小鼠源单克隆
Plant Actin mAb (3T3) 植物细胞总蛋白 42 kD Abbkine A01050 小鼠源单克隆
PCNA mAb (1D7) 细胞核蛋白 28 kD Abbkine A01040 小鼠源单克隆
COX IV mAb (14Y2) 细胞线粒体总蛋白 16 kD Abbkine A01060 小鼠源单克隆
Histone H3 mAb (2D10) 细胞核蛋白 18 kD Abbkine A01070 小鼠源单克隆
标签抗体(Tag Antibody)可用于检测各种商品化表达载体上的标签序列(如:Myc、Flag、His、GST、HA等),籍以分析目的蛋白的表达含量及其功能;
标签抗体:
Anti-Biotin Antibodies
Anti-Dye Antibodies
Anti-FITC Antibodies
Anti-Fluorescent Protein Antibodies
Anti-HRP Antibodies
Beta Galatosidase Antibodies
FLAG Tag Antibodies
GST Tag Antibodies
HA Tag Antibodies
His Tag Antibodies
Myc Tag Antibodies
TAP Tag Antibodies
V5 Tag Antibodies
因为这个实验用到了抗体,抗体是特异识别某一种蛋白的,所以只要能检测到信号,说明样品中有该蛋白存在,如果有相应的对照,也能半定量说明该蛋白的量如何。
因为内参有好几种,分子量差别也比较大,更换分子量与检测蛋白差距更大的内参就可以避免这个问题
另外也可以先用一抗孵育显色和检测,再用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体,重新进行内参的抗体孵育显色检测。这样也可以将检测蛋白和内参显色在同一张膜上
一般可与大鼠、小鼠、人、兔均有交叉反应,即可作为上述任一来源蛋白的内参。
Actin分子量为42kD,为肌动蛋白
GAPDH分子量为36kD,为磷酸脱氢酶
虽然没有具体用过检测这个抗原的抗体,但是如果希望抗体特异性好点,能检测丰度低的蛋白,还是选Abcam吧,Santa有时候全凭人品了,内参抗体什么的还能凑活,其他的比较勉强。
暂无品牌问答