2.1.10寡聚脱氧胸苷纤维素纯化带 poly( A)+RNA一寡聚脱氧胸苷纤维素纯化带 poly( A)+RNA
| 试剂、试剂盒 | NaOH.寡聚脱氧胸苷(oligo(dT)]纤维素DEPC处理的水1X加样缓冲液洗脱缓冲液NaAc(pH5.2)乙醇TE缓冲液。。 实验步骤 | 一材料与设备 1)5mol/LNaOH 2)寡聚脱氧胸苷(oligo(dT)]纤维素 3)DEPC处理的水 4)1X加样缓冲液：20mmol/LTris-CLPH(6.7).0.5mol/LNaCl,lmmol/LEDTA(pH8.0).0.1%十二烷基肌氨酸钠 5)洗脱缓冲液：lOmmol/LTris-Cl(PH7.6)，lmmol/LEDTA(PH8.0)，0.05%SDS 6)3mol/LNaAc(pH5.2) 7)乙醇 8)TE缓冲液 二操作方法 1)先用l0ml5mol/LNaOH清洗硅化的层析柱，然后用水冲洗。取0.5goligo（df)纤维素干粉加于1m]0.1mol/LNaOH中，倒人柱内，以约l0ml的水冲洗。(层析柱可用硅化的巴斯德吸管堵上已硅化的玻璃棉制成或用容量为2ml的已硅化的一次性柱子 2)用10〜20℃加样缓冲液平衡柱子，至流出液pH约7.5 3)于70°C加热含2mg总RNA的水溶液lOmin，迅速冷却至室温，加等体积的2X加样缓冲液，上样，立即用无菌试管收集流出液。并以一倍柱体积的加样缓冲液洗涤，将流出液于70℃温育5min，重新上柱2次。 4)用5〜10倍柱体积的加样缓冲液洗柱，分步收集洗出液，每份1ml，测定每一收集管的OD260。洗脱至OD260很小或为零。 5)用2〜3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A)ˉRNA，以1/3〜1/2柱体积分步收集洗脱液。 6）调整所收集的KNA溶液的乙酸钠浓度至0.3mol/L,加2.5倍体积乙醇，一20℃放置过夜或干冰/乙醇中30min 7)于4°C10000g离心15mim沉淀RNA。弃去乙醇，再用70%乙醇洗沉淀.弃去70%乙醇，晾干沉淀，重溶于少量无RNA酶的TE缓冲液。取在70°C加热5min后，在1%琼脂糖凝胶电泳中检査RNA的质量。 S)poly(A)+1RNA溶液可直接于70℃保存，或加3倍体积乙醇保存于一70℃ 注意事项 | 1)lml的oligo(dT)-纤维素最大载样量为10mg总RNA，如果总RNA的量较少，应减少oligo((dT)-纤维素量.以免poly(A)ˉRNA在过柱和后续步骤中损失。同时也避免浪费。 2)加热RNA可以破坏可能的poly(A)ˉ尾的二级结构。 3)从加样的总RNA中可回收约1%〜2¾puly(A)ˉRNA，从10^7个哺乳动物细胞中可获得1〜5ugPoly(A)+RNA。 4)电泳检测poly(A)+RNA应在20kh以下并呈弥散状，且绝大多数集中在5〜10kb范围 5)十二烷基肌氨酸钠较难溶，若室温低于18℃可能会阻碍柱内液体的流动，可用氯化锂代替加样缓冲液中的氯化钠以解决此问题。 |
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发布于 ： 2021-07-16
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