RNA 的提取和纯化实验
| 试剂、试剂盒 | 氯仿焦碳酸二乙酯乙醇异丙醇苯酚-胍盐单相溶液磷酸盐缓冲液 仪器、耗材 | 离心机和转头移液器离心管锥形管平板匀浆器 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液、溶液和试剂 氯仿 焦碳酸二乙酯（DEPC)处理过的H20(GenHimterR105) 乙醇 70%乙醇洗液（用DEPC处理过的H20配制） 异丙醇 苯酚-胍盐单相溶液（推荐RNApure,GenHunterP501-P503) 磷酸盐缓冲液（PBS) 2.离心机和转头 小离心机 3.专用设备 50ml锥形管 1.5ml小离心管 1000ul(原文为ml。—译者改）移液器 100~150mm平板 P10移液器 Pdytron匀浆器（用于从组织中提取RNA) 二、方法 第一步：RNA提取 方法1:从组织培养物中提取RNA 1.如果细胞贴在瓶壁或平板上，则倒掉培养基，将平板置于冰上。 2.如果细胞是悬浮的，旋转离下细胞，并除去培养基。 3.用10~20ml的冷磷酸盐缓冲液（PBS)漂洗细胞。 4.倒掉PBS，并用1000ul移液器吸去残留的PBS。 5.每100~150mm平板加入2ml苯酚-胍盐单相溶液（RNApure)，以裂解细胞（摇晃平板使溶液分布均匀）。这个体积足够裂解100万~1000万个细胞。 6.将平板放在冰上10min。 7.将裂解液吸到两个标记好的1.5ml离心管中。 方法2:从组织中提取RNA 1.在装有组织的50ml锥形管中，加入至少2ml苯酚-胍盐单相溶液（RNApure),并置于冰上。组织和酚溶液的理想比例至少应该是1:10。 2.用Polytron匀浆器将组织搅匀，直到组织完全分散为止。 3.将管子置于冰上10min。 4.取1ml裂解液，分装到标记好的1.5ml离心管中。 方法3:从血液中提取RNA 1.将血液产品离心，并除去血浆。 2.按照上面从组织中提取RNA的说明逬行操作。 第二步：RNA的纯化 1.每毫升裂解液加入150ul氯仿，涡旋混匀10min。 本方案可以在此处停止，并将裂解液放置在-80°C 2.在4°C以最大转速离心10min。 3.小心地将上清液转移到一个干净的、标记好的1.5ml离心管中。 4.加入等体积的异丙醇，并在冰上放置10min，然后剧烈地混匀或涡旋混匀30s。 5.将混合物在4°C以最大转速离心10min。 6.用1ml预冷的70%乙醇（用DEPC处理过的H20配制）洗涤RNA沉淀，在4°C最大转速离心2min。 7.倒掉乙醇。短暂离心后，用移液器吸去残留的洗液。 8.将RNA在5ulDEPC处理过的H20中重新悬浮。 注意：如果RNA用于任何扩增反应，悬浮液中不要使用SDS。 9.取1ulRNA(用P10移液器）测定浓度，用1mlH20稀释。在260nm下读数，注意1OD260=40ug。 |
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发布于 ： 2021-08-07
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