| 实验材料 | mRNA显示蛋白翻译反应产物 试剂、试剂盒 | Oligo纤维素Oligo（dT）结合缓冲液Oligo洗涤缓冲液Ni-NTA琼脂糖NI-NTA结合缓冲液Ni-NTA洗脱缓冲液鲑精DNABSADNAsplintSuperscriptⅡ逆转录酶缓冲液DTT脱氧核苷三磷酸SuperscriptⅡ逆转录酶脱氧核苷三磷酸溶液ATP-适配体筛选结合缓冲液ATP-适配体筛选洗脱缓冲液 仪器、耗材 | 层析柱凝胶过滤柱 实验步骤 | 实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1.在层析柱中用去离子水反复洗涤20mgoligo（dT）纤维素。重悬纤维素若干次并用正向压力迫使液体快速流出。最后，用oligo（dT）结合缓冲液洗涤一次。 2.用oligo（dT）结合缓冲液将加有KCl和MgCl2的1.3ml含mRNA显示蛋白的翻译反应产物稀释到8.7ml。然后与洗涤过的oligo（dT）纤维素一起在4℃旋转孵育15min。 3.使稀释的翻译反应混合物和oligo（dT）纤维素流过层析柱，oligo（dT）纤维素留在过滤器板上，保留流出液。 4.用1mloligo（dT）结合缓冲液洗涤3次。 5.用1mloligo（dT）洗涤缓冲液洗涤1次。 6.用0.5ml去离子水洗脱3次。 7.用Tris-tricineSDS-PAGE和闪烁计数法分析未稀释的翻译反应混合物、流出液以及所有的洗涤液和洗脱液。 8.用下列算式计算翻译反应混合物中mRNA显示蛋白的浓度： ［mRNA显示蛋白］＝Y-1×C×［甲硫氨酸］×N-1 此处，Y是经SDS-PAGE测定的oligo（dT）纤维素纯化的产量；C是由闪烁计数测定的oligo（dT）洗脱组分合并后的计数值除以等份的翻译反应混合物的计数值；［甲硫氨酸］是指高盐孵育前翻译反应混合物中放射性与非放射性甲硫氨酸的总浓度；N是指在单个显示蛋白中甲硫氨酸的平均数目。 Ni-NTA纯化是基于His6标签，仅适用于库的序列中存在该标签的情况下。 9.用1ml去离子水洗涤100ulNi-NTA琼脂糖3次。 19.将0.5mloligo（dT）洗脱液与2×Ni-NTA结合缓冲液混合，涡旋振荡以溶解，加入0.7ul2-巯基乙醇，4℃下与洗过的Ni-NTA琼脂糖旋转孵育1h。 11.使Ni-NTA结合缓冲液和Ni-NTA琼脂糖流过层析柱，Ni-NTA琼脂糖保留在过滤器板上，保留流出液。 12.于层析柱上进行下列洗涤： a.用500ulNi-NTA洗涤缓冲液1洗涤两次。 b.用500ul4：1的Ni-NTA洗涤缓冲液1/Ni-NTA洗涤缓冲液2洗涤一次。 c.用500ul3：2的Ni-NTA洗涤缓冲液1/Ni-NTA洗涤缓冲液2洗涤一次。 d.用500ul2：3的Ni-NTA洗涤缓冲液1/Ni-NTA洗涤缓冲液2洗涤一次。 e.用500ul1：4的Ni-NTA洗涤缓冲液1/Ni-NTA洗涤缓冲液2洗涤一次。 f.用500ulNi-NTA洗涤缓冲液2洗涤一次。 g.用500ul19：1的Ni-NTA洗涤缓冲液2/Ni-NTA洗脱缓冲液洗涤两次。 h.4℃下用250ulNi-NTA洗脱缓冲液旋转洗脱30min，洗脱两次。 洗脱液中应加入EDTA到5mmol/L以结合被洗脱的Ni2＋。 13.用Tris-tridneSDS-PAGE和闪烁计数法分析起始材料、流出液以及所有的洗涤液和洗脱液。 在Ni-NTA结合和洗涤缓冲液中应避免使用强的螯合剂如EDTA、EGTA和DTT，因为这些试剂能与固相的NTA竞争结合Ni2＋，因而能将之从琼脂糖上洗脱下来。 14.用10ml去离子水流过NAP-5凝胶过滤柱将洗脱缓冲液置换成水。 15.将100ul10mg/ml鲑精DNA与10ul1mg/mlBSA加入890ul去离子水中，涡旋振荡，然后使此溶液流过凝胶过滤柱。 16.使10ml去离子水流过凝胶过滤柱。 17.使0.5ml样品流过凝胶过滤柱。 18.往柱中加入1ml去离子水，从柱底收集1ml洗脱液。 19.用Tris-tricineSDS-PAGE和闪烁计数法分析起始材料和洗脱组分。 29.留出一小份mRNA显示蛋白样品不进行逆转录以用作非RT对照的PCR扩增。 21.于冰上配制下列逆转录反应混合物。在加入RT缓冲液前，先将mRNA显示蛋白与DNAsplint（作为RT引物）混合，最后加入逆转录酶： 900ulmRNA显示蛋白 15ul200umol/LDNAsplint（最终为2umol/L） 300ul5×逆转录缓冲液（最终为1×） 150ul100mmol/LDTT（最终为10mmol/L） 30ul25mmol/L（每个）脱氧核苷三磷酸（最终为0.5mmol/L） 5ul水 10ul200U/ulSuperscriptⅡ逆转录酶（最终为1333U/ml） 总体积1500ul 逆转录反应于42℃孵育50min。 22.用Tris-tricineSDS-PAGE和闪烁计数法分析起始材料和逆转录产物。 除非在筛选实验前先将mRNA显示模板进行逆转录，在筛选实验中使用mRNA显示蛋白可以获得有功能的RNA序列。这还会减少mRNA显示模板干扰所显示蛋白的结构的可能性。最初用mRNA显示筛选出的蛋白质可能需要在逆转录条件下进行孵育以使其形成有活性的构象。 23.参照厂家的说明用NAP-5凝胶过滤柱将缓冲液置换成筛选缓冲液。 24.使10ml筛选结合缓冲液流过凝胶过滤柱。 25.将100ul10mg/ml鲑精DNA与101mg/mlBSA加入890ul筛选结合缓冲液中，涡旋振荡，然后使此溶液流过凝胶过滤柱。 26.使10ml筛选结合缓冲液流过柱子，并使0.5ml样品流过凝胶过滤柱。 27.加入1ml筛选结合缓冲液到凝胶过滤柱的顶端，然后收集1ml柱底流出的洗脱液。 28.用Tris-tricineSDS-PAGE和闪烁计数法分析起始材料和洗脱组分。 表1mRNA显示蛋白的翻译反应 注意事项 | 其他 | 1.材料 1.3mlmRNA显示蛋白翻译反应产物 2.试剂 Oligo（dT）纤维素（AmershamPharmaciaBiotech） Oligo（dT）结合缓冲液 Oligo（dT）洗涤缓冲液 Ni-NTA琼脂糖（Qiagen） NI-NTA结合缓冲液 2-巯基乙醇 Ni-NTA洗涤缓冲液1 Ni-NTA洗涤缓冲液2 Ni-NTA洗脱缓冲液 10mg/ml鲑精DNA（LifeTechnologies） 1mg/mlBSA 200umol/LDNAsplint 5×SuperscriptⅡ逆转录酶缓冲液（NEB） 0.1mol/LDTT 30ul25mmol/L（每个）脱氧核苷三磷酸（最终为0.5mmol/L） 200U/mlSuperscriptⅡ逆转录酶（NEB） 25mmol/L脱氧核苷三磷酸溶液 ATP-适配体筛选结合缓冲液 ATP-适配体筛选洗脱缓冲液 3.耗材 层析柱（Bio-Rad） 凝胶过滤柱（如NAP-5，AmershamPharmaciaBiotech） |
|---|
