用酸性酚硫氰酸胍氯仿提取法纯化组织和细胞中的 RNA
| 实验方法原理 | 在提取过程的第一阶段细胞的RNA酶应尽快灭活。一旦内源的RNA酶被破坏，RNA受损的可能就大大降低，而纯化的过程就可以按合适的速度进行。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 细胞和组织 试剂、试剂盒 | 氯仿乙醇异丙醇液氮苯酚磷酸缓冲盐溶液PBS乙酸钠溶液D（变性液） 仪器、耗材 | 比色杯组织匀浆器研棒和研钵聚丙烯管水浴 实验步骤 | 一、材料 1.溶液与缓冲液 氯仿：异戊醇（49:1，V/V） 乙醇 异丙醇 液氮 苯酚 磷酸缓冲盐溶液PBS（仅供悬浮细胞和单层细胞用） 乙酸钠（2mol/L，pH4.0） 溶液D（变性液）  去离子甲酰胺（可选） 细胞和组织 2.离心与转子 SorvallSS-34(或与之相当的转子）；SorvallH1000(或与之相当的转子） 3.专用设备 测260nm吸光率的比色杯 组织匀浆器 用DEPC水处理过、预冷的研棒和研钵 聚丙烯管 65℃水浴 二、方法 1.选取从组织或细胞中提取RNA的适宜方法 (1)组织 ①分离组织并立即置于液氮中。 ②将约100mg冰冻组织含液氮的研钵中，用研棒研磨。研磨过程中可加入液氮使组织保持冰冻状态。 ③将组织碎末移入含3ml溶液D的管中。 ④用搅拌子室温下搅拌组织15~30s。 (2)哺乳动物悬浮细胞 ①室温下200~1900g离心5~10min(1000~3000r/min用SorvallRT600,H1000转子）收获细胞。 ②吸出培养基将细胞重悬于1~2ml冰预冷的PBS中。 ③离心收获细胞，彻底吸尽PBS,每106细胞加2ml溶液D。 ④用搅拌子室温下搅拌细胞15~30s。 (3)哺乳动物单层培养细胞 ①吸出培养基用5~10ml冰冷的PBS洗细胞一次。 ②吸出PBS加入溶液D覆盖细胞，90mm培养皿加2ml(60mm培养皿加1ml)。 ③将细胞溶解物移至管中。 ④用搅拌子室温下搅拌溶解细胞15~30s。 2.将混合物移至一管中，在每毫升溶液D中立即加入0.1ml2mol/L的醋酸钠(pH4.0),1ml酚，0.2ml氯仿-异戊醇。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。 3.将匀浆剧烈振荡10s。冰浴15min使核蛋白质复合体彻底裂解。 4.10000g(9000r/min用SorvallSS-34转子）4℃离心20min,将上层含RNA的水相移入一新管中。 5.加入与提取的RNA等量的异丙醇。充分混合液体，并在-20℃沉淀RNA1h或更长时间。 6.10000g(9000r/min用SorvallSS-34转子）4℃离心30min,收集沉淀的RNA。 7.轻轻倒出异丙醇加入溶液D溶解RNA颗粒，每1ml第一步所使用的溶液加0.3ml溶液D。 8.将溶液移至一微量离心管，涡旋混匀，并在-20℃用等量异丙醇沉淀RNA1h或更长时间。 9.在微量离心机上，于4℃最大速离心10min收集RNA沉淀。用75%的乙醇洗涤沉淀2次，重复离心。用一次性使用的吸头吸出残存的乙醇。将打开盖的离心管在实验台放置几分钟，以便乙醇蒸发。RNA不可完全干燥。 10.加50~100μlDEPC处理过的水。将RNA溶液贮存于-70℃。 11.估计RNA的浓度。   |
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发布于 ： 2021-08-11
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