Synthesize"RNA"transcriptsthatalsocontainstandardormodifieddNTPsusingthismutantT7RNApolymerase
- Generate"RNA"transcriptswithbothrNMP/2´-dNMPorrNMP/2´-modified-NMPcomposition
- Createmodified"RNA"transcriptsthatareresistanttoRNaseA-typeRNases
- Useforavarietyofapplicationswhere"RNA"withincorporateddNTPsisbeneficial
T7R&DNA™Polymerase*isarecombinantmutantformofT7RNApolymerase(Y639Fmutant),inwhichTyr-639hasbeenreplacedbyPhe.1,2ThismutationenablesT7R&DNAPolymerasetoincorporate2´-deoxyribonucleosidetriphosphates(dNTPs)intofull-lengthtranscriptsmuchmoreefficientlythanthecorrespondingwild-typeenzyme,1whileretainingthesamecatalyticactivityforincorporationofcanonicalNTPs,andthesamehighpromoterspecificityaswild-typeT7RNAPolymerase.TheABIlityofthismutantenzymetoincorporatecertain2´-modified-dNTPs(includingbutnotlimitedtodNTPshavinga2´-fluorineor2´-aminogroup)enablesefficientinvitrosynthesisoftranscriptscomposedofmixedrNMP/2´-dNMPorrNMP/2´-modified-dNMPfromanyDNAtemplatethatisdownstreamoftheT7RNApolymerasepromoter.Suchmodifiedtranscriptsareusefulformanyapplications.
Note:Completesubstitutionofone2´-dNTP(orone2´-modifieddNTP)foracanonicalrNTPinaT7R&DNAPolymerasereactionresultsinaslightdecreaseinyield.Additionalsubstitutionsof2´-dNTPs(or2´-modified-dNTPs)forcanonicalrNTPswillfurtherreduceyieldofthetranscriptproduced.Substitutionwithallfour2´-dNTPs(or2´-modifieddNTPs)willresultinextremelylowyieldsoftranscriptandisNOTRECOMMENDED.
UnitDefinition:OneunitofT7R&DNAPolymerasecatalyzestheincorporationof1nmolofribonucleosidetriphosphateintoRNAin1hourat37°CunderstandardassayconditionsusingaDNAtemplatewiththeT7promoter.
StorageBuffer:50%glycerolcontaining50mMTris-HCl(pH7.5),0.1MNaCl,1.0mMDTT,0.1mMEDTA,and0.1%Triton®X-100.
5XTranscriptionBuffer:0.2MTris-HCl(pH7.5),50mMNaCl,30mMMgCl2,and10mMspermidine.
References
- Sousa,R.andPADIlla,R.(1995)EMBOJ.14,4609.
- U.S.PatentNos.5,849,546and6,107,037.
*Coveredbyissuedand/orpendingpatents.
ORDERINFORMATION
Contents:T7R&DNA™Polymerase,5XReactionBuffer,100mMDTT.ebiomall.com
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DNA连接酶主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键最初从原核生物(大肠杆菌)分离得到的.现在生物基因工程主要是从T4噬菌体中分离得到的,
酶对所作用的底物有严格的选择性。一种酶仅能作用于一种物质,或一类分子结构相似的物质,促其进行一定的化学反应,产生一定的反应产物,这种选择性作用称为酶的专一性。
连接酶通常是包括“连接酶”这个字,就如DNA连接酶是将脱氧核糖核酸(DNA)片段连接。其他普遍的名称包括“合成酶”,因为这些酶是用作合成新的分子,或当它们是将二氧化碳加入一个分子时则称为“羧化酶”。
菌体构建时,目的基因连接在T载体上,测序也正确,但是将目的基因还有载体分别双酶切后总是连接不上,将连接后产物跑核酸胶,什么也没有,不知道是什么原因?我的目的基因浓度为9ng/ul,载体回收后的浓度为6ng/ul,是因为浓度太低的原因吗?还有就是连接有目的基因的T载体双酶切后出现了三条带,这个又是什么原因呢?希望得到解答
大家有用过Invitrogen的T4连接酶吗?说明书上是23-26度连接,一般的连接酶不都是16度吗?应该用多少度呢?另外,说明书上还说连接后为了达到更好的转化效率,应将连接反应液至少稀释5倍再转化,是这样吗?谢谢大家帮忙啊
连接酶有T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平端,也连接粘端。反应需有Mg2+和ATP存在,pH7.5-7.6。最适温度37℃,30℃以下活性明显下降,但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端的退火温度,一般平端连接用20-25℃,粘端连接用12℃左右。
聚合酶有DNA聚合酶(以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ,大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow大片段),T4或T7噬菌体DNA聚合酶等);RNA聚合酶(以DNA为模板合成RNA,T7或T3噬菌体RNA聚合酶);逆转录酶(以RNA为模板合成DNA,除RNA病毒中发现外,发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆转录活性)。
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′,3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段,有5′→3′聚合酶和3′→5′外切酶活性,无5′→3′外切酶活性。可用于缺口翻译(Nick translation)法标记核酸,也可用于DNA序列测定,修补DNA链等。向左转|向右转
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