Accuris High Fidelity DNA Polymerase
· 50X higher fidelity than Taq DNA polymerase.
· Works with crude DNA samples.
· Ideal for cloning, mutagenesis and microarrays.
· Optimized buffer system with unique PCR enhancers.
For applications requiring highly accurate amplification, choose Accuris High Fidelity DNA Polymerase. Modified for better sensitivity and higher activity for more reproducible performance, this polymerase will amplify a wide range of targets, including those that are GC or AT rich as well as crude samples. A 3-5 proofreading exonuclease activity and an error rate of 4.55x10-7 makes Accuris High Fidelity DNA Polymerase the perfect partner for cloning applications. The supplied 5X buffer with dNTPs is optimized for compatibility with a variety of targets.
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大家有用过Invitrogen的T4连接酶吗？说明书上是23－26度连接，一般的连接酶不都是16度吗？应该用多少度呢？另外，说明书上还说连接后为了达到更好的转化效率，应将连接反应液至少稀释5倍再转化，是这样吗？谢谢大家帮忙啊
DNA连接酶主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键最初从原核生物（大肠杆菌）分离得到的.现在生物基因工程主要是从T4噬菌体中分离得到的,
只不过限制性核苷酸酶是将磷酸二酯键切断；而DNA连接酶则是形成磷酸二酯键。
有没有人用过NEB的Blunt/TALigaseMasterMix和InstantSticky-endLigaseMasterMix？
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.....它说连得又快又好，想问问有木有小白鼠试过它家的这两个产品呢。。如果用过能不能请教下效果咋样呢。。我之前用Thermo的T4，属于又便宜又慢效果还可以的那类型的。。（虽然说thermo也说室温30min就ok，但是还是4度过夜了，室温30min不靠谱）
沙利度胺及其衍生物通过引起两种转录因子缺失，进而达到治疗各种血液系统恶性肿瘤的惊人功效。
免疫调节剂（IMiD）沙利度胺、来那度胺和泊马度胺这些小分子药物结合到cereblon（CRBN）蛋白上，随后CRBN激活CRBNE3泛素化连接酶复合物的活性。转录因子Ikaros（IKZF1）和Aiolos（IKZF3）在经过泛素（ubiquitin,Ub）分子修饰后发生降解。这一过程将会改变T细胞和B细胞的功能，并对多发性骨髓瘤（multiplemyeloma）细胞产生毒性效应。
作用机制的发现历程：
沙利度胺（Thalidomide）走过了一段长达55年的莎士比亚式的历史，期间充满了意想不到的后果、灾难、坚韧、执着和赎罪。的确，这个在现代社会中最臭名昭著的药物曾经造成的大范围、极具毁灭性的出生缺陷至今仍然牢牢地扎根于公众的意识之中。而鲜为人知的是，沙利度胺已经“东山再起”，成为血液系统恶性肿瘤的一种治疗药物。沙利度胺及其衍生物通过降解两种转录因子——Ikaros和Aiolos，从而对多发性骨髓瘤产生毒性作用。这两种转录因子的缺失会终止骨髓瘤的增长，同时还可以改变免疫细胞的功能。
早在15年前就有报道指出，作为一个典型的药物重新定位（drugrepositioning）的案例，沙利度胺可能能够非常有效地治疗多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤患者的骨髓中存在有可产生抗体的浆细胞，这种恶性肿瘤的病症特点是贫血、骨折、肾功能衰竭与反复性感染。随后研究者们证明，沙利度胺的衍生物来那度胺（Lenalidomide）与泊马度胺（Pomalidomide）（统称为免疫调节药物或IMiD）也能够治疗多发性骨髓瘤，且治疗效果更好；如今，这些小分子药物成为了卓有成效的一线疗法，被用于治疗这种可治愈性越来越高的多发性骨髓瘤及其它血液系统恶性肿瘤。
这些年来，许多研究试图解释沙利度胺致畸作用的机制。有研究发现，沙利度胺、来那度胺和泊马度胺可以产生一系列广泛的、看似毫不相干的细胞作用，包括诱导氧化应激、抑制血管生成，同时还能对免疫系统产生多种效应——增加白介素2（interleukin-2,IL-2）（此类细胞因子可刺激T细胞的生产）的产生量，抑制肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）的活性，并且能刺激自然杀伤细胞。沙利度胺抗血管生成的特性启发人们提出了这样一个建议：沙利度胺可能是控制耐药性多发性骨髓瘤的最后尝试。随后，人们就用沙利度胺成功地控制住了这种肿瘤。然而遗憾的是，人们很快就发现：尽管抗血管生成是沙利度胺疗法的作用之一，但是却并不能解释其临床疗效的作用机理。
2010年出现了一个重大的突破：研究者们发现沙利度胺能与一种名为cereblon的蛋白质相结合。cereblon能与损伤DNA结合蛋白1（damagedDNAbindingprotein1,DDB1）、Cullin-4A（CUL4A）、cullins1调控子（Roc1）结合，形成E3泛素连接酶复合物。这种复合物利用泛素来标记特定的蛋白，随后再水解这些蛋白质。沙利度胺与cereblon蛋白之间的相互作用能够干扰E3泛素连接酶复合物的活性，而这种活性恰恰是IMiD发挥细胞毒性效应和免疫调节效应的基础。在经过IMiD治疗后，E3泛素连接酶复合物的下游蛋白质，例如干扰素调节因子4（interferonregulatoryfactor4,IRF4）和Myc等转录因子的表达水平会降低；而这些下游蛋白的过量表达，也能够逆转IMiD的某些效应。尽管有关该现象临床重要性的研究仍然处于起步阶段，但很明显，多发性骨髓瘤细胞中含量较低的cereblon与临床耐药和不良生存结局有关。
cereblon还可以选择性地结合于含有锌指结构的转录因子Ikaros（IKZF1）和Aiolos（IKZF3）上。当IMiD直接结合到cereblon上后，就能够激活cereblon的E3连接酶活性，从而使Ikaros和Aiolos迅速发生泛素化和降解。Ikaros与Aiolos是B细胞和T细胞发育所必需的转录调控因子。而小鼠浆细胞的正常发育需要Aiolos的存在。这两种转录因子缺失后会对多发性骨髓瘤细胞产生毒性效应，但如果在IMiD药物治疗前将Ikaros上关键的cereblon结合区域除去，就能够逆转这些毒性效应。在正常情况下，Ikaros能够抑制T细胞中IL-2编码基因的表达，但反过来又能刺激IRF4（一种能对感染产生应答反应的转录因子）的表达。因此，Ikaros水平的下降解释了以下这个复杂问题：一种IMiD药物是如何能够在激活免疫系统（T细胞所产生的IL-2增加，从而刺激免疫应答反应）的同时，又减弱B细胞功能（为IRF4表达量减少所产生的结果）的？
研究者们通过分析cereblon–Ikaros/Aiolos–IRF4/Myc信号通路，为研发出更精确有效的治疗方法和药物反应生物标志物开启了一扇大门，并且也向生物学家和临床医师们提出了更多的问题。例如，Ikaros的缺失既是一个有效的抗肿瘤靶点，同时也是一种促使急性淋巴细胞性白血病（acutelymphoblasticleukemia，ALL）发生的肿瘤抑制因子，其中的作用机制如何？这大概是因为不同的Ikaros亚型能够在不同的细胞状态下发挥基因表达调控因子的作用。一种符合逻辑的进程是：IMiD在失常的细胞环境下造成Ikaros缺失，从而能够在杀伤多发性骨髓瘤细胞的同时，促进B细胞性白血病癌前期的发生。临床经验也确实表明，接受了免疫调节药物治疗的患者罹患白血病和B细胞性恶性肿瘤的风险略有增加，尽管他们的发病风险是在服用了另一种具有遗传毒性的DNA损伤性药物，例如美法仑（Melphalan）（一种常用的多发性骨髓瘤治疗药物）后才增高的。目前仍然有其它无法解释的临床难题，例如为什么只有三分之一的复发患者会对单一免疫调节药物产生反应？为什么患者在失去了cereblon蛋白或找到了替代的信号通路之后，就会对这些药物产生耐药性？
另一个令人费解的临床难题是：IMiD药物在发挥作用时，似乎一定需要对Ikaros和Aiolos进行有效的蛋白酶体降解——这一发现与临床经验正好相反，似乎证明了联合使用免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂是一种治疗多发性骨髓瘤的高效策略。显然，沙利度胺及其衍生物所创造的科学传奇是一个仍未被充分告知的故事。
这些能够增加特定靶蛋白的泛素化水平和降解水平的小分子药物可能是一类新型的治疗方法，能够控制那些以往被认为无法用药物靶向的蛋白质。
连接酶有T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平端，也连接粘端。反应需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6。最适温度37℃，30℃以下活性明显下降，但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端的退火温度，一般平端连接用20-25℃，粘端连接用12℃左右。
聚合酶有DNA聚合酶（以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌体DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA为模板合成RNA，T7或T3噬菌体RNA聚合酶）；逆转录酶（以RNA为模板合成DNA，除RNA病毒中发现外，发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆转录活性）。
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段，有5′→3′聚合酶和3′→5′外切酶活性，无5′→3′外切酶活性。可用于缺口翻译（Nick translation）法标记核酸，也可用于DNA序列测定，修补DNA链等。向左转|向右转
酶对所作用的底物有严格的选择性。一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质，促其进行一定的化学反应，产生一定的反应产物，这种选择性作用称为酶的专一性。
DNA连接酶:可以连接被限制酶切割开磷酸二酯键
求有经验的大神指教，我的载体和目的基因连不上，转化不到大肠中，比例为1:3。另外，为啥胶回收后的载体浓度那么低，大约6ng/ul了，影响连接么？
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