一、免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化,不同点如下: 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理,封闭和一抗孵育与其它相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育,孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油:0.01MPBS(1:1)。 5、条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中,标本可以保存更久。 6、荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。 7、荧光抗体染色假阳性可能会多,需要设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长,会使荧光减弱。 2、每次试验时,需设置以下三种对照: (1)阳性对照:阳性血清+荧光标记物 (2)阴性对照:阴性血清+荧光标记物 (3)荧光标记物对照:PBS+荧光标记物 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取primaryantibodies时要来源于两种不同的动物,我用的是来源于rabbit和rat的抗体,secondaryantibodies则是不同荧光信号标记的,我用的是donkeyanti-rabbit-FITC(绿)和donkeyanti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种primaryantibodies同时孵育,然后两种secondaryantibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索,我感觉primaryantibodies4度孵育过夜比较好,背景比较干净。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是rABItt和rat的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、Block用的血清使secondaryantibody来源动物的血清,我的是10%正常donkey血清。 5、其余同一般操作。