6.染色的选择 OO.WesternBlot哪种染色好？解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。 7.参照的疑问 PP.是否WesternBlot实验半定量一定要加ACTIN内参？解答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。 QQ.用BANDSCAN分析结果行吗？解答：分析一般的结果没问题。 RR.核内抗原WesternBlot内参选择什么合适？解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。 SS.转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2，一般1小时左右？解答：不是的，半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。 TT.做半定量人卵巢癌细胞系的WesternBlot，内参B-actin，GAPDH，那个好？解答：选用beta-actin就可以。 UU.转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris－HCl就是Tris盐用HCl调ph值，配置而成。 VV.准备做大鼠脑子的WesternBlot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。 WW.想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？解答：一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。 XX.最近作了两次WesternBlot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？3、第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为0.1%，不会是封闭液的问题吧？解答：可以在下面几个问题上找找原因。1.封闭液用5％Milk，漂洗液（washingbuffer用TBST）2.看看一抗是否能work，降到1：20。3.看看二抗是否有问题。 YY.加甲醇的目的是什么？解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。 ZZ.“转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？解答：是Tween，配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20(TBST),Dissolve8.8gofNaCl，0.2gofKCl，and3gofTrisbasein800mlofdistilledH2O,Add500ulofTween-20,AdjustthepHto7.4withHCl,AdddistilledH2Oto1L,Sterilizebyautoclaving. AAA.封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如现在我就在室温里做，或者要在4度下?解答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。 BBB.实验室暂无NP40我用sds可以吗？另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？配方如下：7M尿素，2M硫脲，Triton-x-1000.2ml，新鲜加入：65mMDTT蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTMProteaseinhibitorcocktailkit1%(v/v)是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？改良的RIPA裂解缓冲液(Tris.HCl，50mmol/L，pH7.5;NaCl，150mmol/L;NP-40，1%;脱氧胆酸钠，0.5%;SDS，0.1%;EDTA，1mmol/L;PMSF，1mmol/L;Leupeptin，2μg/ml)不知对于膜蛋白效果如何？此外该方中的EDTA，是否用做蛋白酶抑制剂？解答：做２－Ｄ绝对不推荐使用ＮＰ－４０（因为即使进口的ＮＰ－４０也不纯，，其中的杂质会影响质谱结果）。对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail，因为7M尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性，２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。ＥＤＴＡ用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加过多的蛋白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做ＷＢ无所谓，做ＭＡＩＬＤＩ时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质(在2-D裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：提供连续的PH梯度，从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一部分核酸)；也不推荐采用SDS，因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变，如果您实在要用，终浓度降到0.1%以下。
