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DNA序列的PCR引物设计
2017-10-01
问题描述:

5’-TCGATGCGACACGACTGAGCCTA-3’
帮忙设计这段DNA序列的2个引物,forwardprimer还有reverseprimer,要只含有6个bp
麻烦写详细3端和5端,可以的话写下设计方法,感激不尽啊
刚开始学很是困惑,老师也没详细讲。。。

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jcsjcs1987
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1,PCR引物是利用碱基互补原则,通过找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。2,首先要找到你用来设计引物的目的基因全序列,一般NCBI、Genebank上都能找得到。3,引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导 致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应;引物3’端尽量不要出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,这样会会增加错配几率,3’端尽量不要以A为结尾; 引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大; ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳 定性。应当选用3’端ΔG值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应;对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物 的载体的相应序列而确定。
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paraake
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疯了………………你这个是要实验用还是要交作业啊…………引物设计首先需要找到你要P出来的序列。让我们假设这一段就是你要P的东西………………第二步就是在该序列或者附近直接用原序列做引物。你这个为例的话,5'就是TCGATG,而3'就是TAGGCT。注意5'就是原序列而3'则是互补序列。还需要注意的是,两个primer都是5'-3'的写法。第三步则应该是在全序列中寻找这两个引物是否会出现错配,以及错配的严重情况。错配严重的在PCR之后会出现较小的杂带。还有就是引物自身会不会出现发夹(就是引物自己的局部会发生错配),两条引物会不会形成互配等等(这些都是不存在为最好的)。这两个会影响PCR产物的量,严重的会没有产物形成。因为是做PCR的,还需要检查两条引物的TM(变性解聚需要的最低温度)值是否接近(接近为好)。真正设计引物的时候经常还需要考虑加入酶切位点,这样的话,酶切位点因为是回文结构,错配就会无法避免,不用考虑了。基本上设计引物的要点就是这些了。有什么不懂的你再补充。回答补充:至少我老师给我讲引物设计的时候,没有说过开头能否使用CG之类的东西……关于引物中GC的问题,一般说其含量在40~60%左右时,P的效果最好。但是也有人用实验证明小于或大于这个范围同样可以做的很好。上次还忘记说了,引物设计中比较关键的是3'端。那里的序列是不能动的,因为P的时候就是3'端的紧密结合开始的。相对的,如果要做任何改动,可以考虑5'端,但也最好不要直接从头开始改。留下几个碱基作为保护碱基可以提高引物的效果。展开
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cranek
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下载一个primer premier吧有引物设计功能 可以计算自有能变化 以及各种回文 错配结构的稳定性很有用
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我—不是张三疯
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forward primer - 5‘ GCTCGA 3'reverse primer - 5 ' GCTAGG 3'
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