不知不觉几年下来自己也快毕业了，感谢丁香园这些年来的帮助。没有什么可回报的东西，就教教新人如何设计引物吧，尽量做到手把手的教，图文并茂。
丁香园论坛中关于引物设计的帖子不少，以前很多站友会推荐Oligo、PrimerPremier、DNAman等等软件。这些软件设计完最后还是要去BLAST比对下，所以我教大家一种易懂实用的在线设计方法。
就以人的PTEN基因为例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是CDNA，就找它的mRNA序列。如果你要做的是DNA，就找DNA的序列。
以cDNA为例，普遍的一种方法是上Pubmed中GENE栏搜索找到cDNA那栏，但Pubmed导出序列不太方便，我介绍个网站http://asia.ensembl.org/index.html。
1.输入目的基因，进入。
2.在左侧栏选择TRANSCRIPT，选择后进入。
3.选择PTEN-001中的TRANSCRIPT进入，点击左侧cDNA。
4.然后点击CONFIGURETHISPAGE进入设置你要显示的内容。
5.除了第一栏SHOWEXONS选择YES外，其他的都选择NO，然后取个名字保存SAVECONFIGURATIONAS。
6.然后在左侧栏点击DOWNLOADVIEWASRTF可下载你要的cDNA序列，这个文件可以用WORD打开，不同的颜色代表一个外显子间断。
下载后打开的Word。
7.然后根据可以根据你感兴趣的序列设计引物了，比如我在分别在第6和第7外显子分别设计上下游引物。选取并复制第6和第7外显子序列。
8.登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，粘贴这段序列，设置好RANGE和PCR产物的大小，然后在下面点击GETPRIMERS，可以在线设计并比对引物。
9.最后选择一个比较特异性的引物，条带大小要尽量单一，其他的基因序列尽量不要比对到。
文章来源：xiaozou55
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