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将EntransterTM-invivo与AmbioninvivosiRNA(作用于凝血因子VII)和阴性siRNA通过尾静脉注射成年小鼠,2天后,取动物肝脏检测。在mRNA水平和蛋白水平观察干扰效果。见上图,图中最左侧组为对照组注射阴性siRNA为3mg/kg,后边3组为每kg动物注射阳性siRNA量分别为1mg/kg,2mg/kg和3mg/kg情况。
根据推荐用量注射EntransterTM-invivo和siRNA(作用于LaminA/C)和阴性siRNA到成年小鼠。注射后2天收集相应的组织,分离RNA,用qRT-PCR分析LaminA/C基因的表达水平。图4为尾静脉结果,图5为各器官分别局部注射结果。
英格恩生物体内转染试剂,3天可完成动物体内转染实验,让动物干扰,基因敲除实验变得简单、快速有效!
近期,北京大学基础医学院鲁凤民教授课题组与许中伟、夏宁邵教授等合作,在《Theranostics》杂志上在线发表了题为“ThegRNA-miRNA-gRNAternarycassettecombiningCRISPR/Cas9withRNAiapproachstronglyinhibitshepatitisBvirusreplication”的研究论文。该研究通过模拟microRNA(miRNA)的生成过程,整合双gRNA导向的CRISPR/Cas9和RNA干扰技术,高效破坏乙型肝炎病毒(HBV)的复制模板-共价闭合环状DNA(ccCDNA),探索病毒清除新路径。北医王杰讲师、陈然和张瑞阳博士研究生为该论文的共同第一作者。
目前,我国仍有慢性HBV感染者约7800万人,慢乙肝患者约2800万人。HBV感染仍是我国病毒性肝炎、肝硬化及肝癌的重要致病因素。作为HBV复制模板的cccDNA,由于其半衰期相对较长,加上cccDNA池的不断补充,使得细胞核内的cccDNA持续存在、感染慢性化。目前,临床上治疗慢乙肝的常用药物为核苷(酸)类似物和长效干扰素,二者均不直接作用于cccDNA,难以有效清除病毒实现临床治愈。因此,研发直接靶向cccDNA的药物,寻找清除cccDNA的新方法和新策略,是当前慢乙肝治疗药物研发的热点。
该研究以miRNA-31为基本骨架,通过模拟其核心序列的二级结构设计HBV特异的miRNA(miR-HBV),miRNA两侧侧翼序列为特异性靶向cccDNA不同位点的引导RNA(gRNA)。如图所示,该gRNA-(miR-HBV)-gRNA三联体表达体系导入细胞后,在细胞核内转录形成gRNA-(miR-HBV)-gRNA长转录本,经内源的Drosha/DGCR8复合体剪切,形成2个gRNA和1个miR-HBV前体(pre-miR-HBV)。进入细胞质后,pre-miR-HBV进一步经Dicer酶剪切,形成成熟的miR-HBV。一方面双gRNA导向的CRISPR/Cas9系统通过切割并去除cccDNA的关键调控和编码序列直接破坏cccDNA,另一方面通过miR-HBV在转录后水平抑制HBV复制,进而抑制cccDNA池的补充,协同促进HBVcccDNA的清除。此外,本研究还发现,当pri-miRNA-31的侧翼序列长度为38bp时与双gRNA组成的三联体对HBV复制的抑制效率最高。
双gRNA导向的CRISPR/Cas9整合RNAi技术高效抑制HBV复制模式图
当然,该技术离临床应用尚有较远的距离。一方面如何高效和靶向性地将三联体递送到HBV感染的肝细胞内是需要攻克的一大障碍;另一方面,CRISPR/Cas9基因编辑技术的脱靶效应也有安全性之虞。然而,近年来随着Cas核酸酶的不断改造,其脱靶效应得到了有效控制,安全性大为提高。而且,随着金黄色葡萄球菌Cas9的发现,使得CRISPR/Cas9系统可以装入腺相关病毒载体中,致使该技术应用于临床的距离逐渐缩短。
总之,本研究通过gRNA-(miR-HBV)-gRNA三联表达框架联合CRISPR/Cas9和RNA干扰技术高效破坏cccDNA,促进HBV清除,为慢乙肝抗病毒治疗提供了新的思路。该项研究得到国家十二五重大科技专项计划“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”项目和国家自然科学基金的支持。
论文链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28839466
简单来说,Off-target效应就是指干扰shRNA序列进入了microRNA途径,通过microRNA途径,其可以不受完全互补的限制而调控大量靶基因的表达。原本需要19~23nt的RNA序列完全互补才能发生干扰作用,而如果进入microRNA途径,只需要11~15nt互补就可以产生干扰效果,这使得siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默,造成脱靶。 如果脱靶干扰的部分基因,正好与目的基因位于同一信号通路中,或者与目的基因的生物学功能相似,那么,如果因脱靶而干扰了其它基因,亦会造成和目的基因受到干扰后相同的细胞表型改变。而实际上,可能选择的这条shRNA序列并没有对目的基因造成有效干扰,或者虽然干扰了目的基因,但是并不会引起预期的细胞表型改变。
基于以上原因,自从Off-target效应被发现并被研究者们广泛认同后,越来越多的杂志要求研究者们在投稿时需要有相应的对照来说明Off-target效应。即您需要有相关对照或者实验来说明,您所获得的实验结果,不是由于Off-target效应而产生的。向左转|向右转
dsRNA(double-stranded RNA)介导基沉默作用dsRNA基点研究基沉默机制热点dsRNA指于30碱基RNA哺乳物细胞至少2条路径竞争双链RNA(dsRNA)其特异性路径:特殊dsRNA序列用于RNAi起始阶段dsRNA切siRNA(small interfering RNA 或short interfering RNAs)siRNARNA干扰作用赖发重要间效应能提供定信息允许特定mRNA降解siRNA义链与反义链各21碱基其19碱基配再每条链3’端都2配碱基
另条非特异性路径:要dsRNA存降解所RNA抑制所蛋白质合dsRNA激蛋白激酶PKR激PKR通系列磷酸化关闭翻译起始导致翻译抑制通激2’-5’AS 合激RNase L导致非特异RNA降解
关于特异性RNA作用机制模型包括起始阶段效应阶段起始阶段dsRNADicer酶(RNaseIII家族特异识别双链RNA员属内切核酸酶)作用加工裂解21-23核甘酸干扰RNA片断(siRNA)Dicer含解旋酶性及dsRNA结合域PAZ结构
RNAi 效应阶段siRNA双链结构解旋并形性蛋白/RNA复合物(RNA-induced silencing complex or RISC)siRNA 解双链即RISC激程需ATP由RISCsiRNA反义链与mRNA互补区域结合随切割mRNA达RNA水平干扰基表达RISC由种蛋白组包括核酸酶解旋酶同源RNA链搜索性等
请有经验的战友指点,若可以最好能提供几篇应用动物进行RNA干扰研究的文章.
非常感谢!
本是小菜鸟,目前研究某个比较新的蛋白对内质网应激的影响,需要抑制这个蛋白的表达看下游信号的表达情况,但是无论如何夜找不到抑制剂,做RNA干扰的话经费就超出预算了!急求各位大神,帮忙出个解决方案吧!非常感谢!
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