作者：李奇灵孙阳珍于月成方静张媛丽辛晓燕

【关键词】exosomes；腹水；卵巢肿瘤；细胞培养技术

Comparisonofextractionmethodsofexosomesfrompatientswithovariancancer

【Abstract】AIM:Tocomparetheextractionmethodsofexosomesfromtissueorascitesofanadvancedovariancancerpatient,todetecttheexpressionofexosomesoftwosource,andtoexplorethebestpathwayofacquiringexosomes.METHODS:Thetissueofovariancancerwastakenandthecancercellswereseparatedandcultured.Thecellculturesupernatantwascollected.Theasciteswascollectedfromthesamepatient.Theexosomeswereextractedbyultracentrifugationandultrafiltrationfromthecellculturesupernatantandtheascitesandwereexaminedunderelectronmicroscope.HSP70,HSP90,MHCclassⅠmoleculeandMHCclassⅡmoleculeonexosomesweretestedbyWesternblotting.TheprotEinconcentrationofexosomeswastestedbyBCAmethod.RESULTS:Thetimeforthecentrifugationofasciteswaslongerthanthatofsupernatant.Theexosomescouldbeobtainedfromallofthesupernatantsandtheasciteswithcancercells,notfromtheasciteswithoutcancercells.TheexosomesexpressedMHCclassⅠmolecule,HSP70andHSP90exceptMHCclassⅡmolecule.Theproteinconcentrationofexosomesintheasciteswashigherthanthatofthesupernantantofcellculture(P0.05).CONCLUSION:Ascitesisabettersourceofexosomesfortheovariancancerpatientwithmalignanteffusionwithpositivecancercells.Theexosomescanbeextractedfromovariancancertissueforthepatientswithoutascitesorwithascitesinwhichcancercellsarenegative.

【Keywords】exosomes;ascites;ovarianneoplasms;cellculturetechniques

【摘要】目的：同一晚期卵巢癌患者，对组织来源和腹水来源的exosomes进行方法和数量的比较，探讨获得卵巢癌患者exosomes的最佳途径.方法：收集晚期卵巢癌患者卵巢癌组织，分离癌细胞进行培养，留上清液，取同一患者的腹水，通过超速离心和超滤等方法提取上清液及腹水中的exosomes,电镜下检测；WesternBlot测定exosomes上HSP70,HSP90,MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子的表达；用BCA蛋白测定法测定exosomes的蛋白浓度,计算蛋白总含量.结果：腹水离心时间比上清液离心时间长，所有细胞培养上清液和癌细胞阳性的腹水均能分离出exosomes，癌细胞阴性的腹水中未分离出exosomes；两种来源的exosomes共同表达MHCⅠ类分子、HSP70和HSP90，均不表达MHCⅡ类分子，腹水中分离出来的exosomes蛋白含量比细胞培养上清液的含量高（P0.05）.结论：腹水中癌细胞阳性的患者，腹水是exosomes的比较理想的来源；无腹水或腹水中癌细胞阴性的患者，exosomes可来源于卵巢癌组织.

【关键词】exosomes；腹水；卵巢肿瘤；细胞培养技术

0引言

exosomes是许多种细胞都能分泌的直径30～90nm的小囊泡，由蛋白质和脂质组成的亚细胞器.近年来，癌症患者的肿瘤细胞和树突状细胞（dendriticcell,DC）分泌的exosomes，由于它携带所分泌细胞的一些抗原信息，被作为肿瘤特异性抗原的来源，用于恶性肿瘤免疫治疗［1-2］的研究.由DC分泌的exosomes已经在黑色素瘤和非小细胞肺癌进入了临床Ⅰ期试验［3］,但exosomes在卵巢癌中的研究进展较慢.本研究我们对晚期卵巢癌患者组织来源和腹水来源的exosomes分离方法、获得量比较，探讨卵巢癌患者最佳exosomes来源途径.

1对象和方法

1.1对象选择200501/200512在西安交通大学第一附属医院妇产科住院的原发性卵巢癌患者15例，年龄（53±6）岁.临床分期Ⅲ～Ⅳ期，均伴有腹水，腹水中查出癌细胞者10例(10/15)，腹水中癌细胞阴性者5例(5/15).取标本前未经化疗，均为第一次剖腹探查，术中无菌操作留取卵巢癌组织，术前或术中留取腹水.术后病理诊断，浆液性囊腺癌9例，黏液性囊腺癌6例.

99.93%重水购自Sigma公司；RPMI1640培养液购自Gibco公司；Centriplus离心超滤管（100KDa）、AmiconUltra高回收率高流速切向流超滤离心管（100KDa）购自美国Millipore公司；兔抗人热休克蛋白（HSP70）多克隆抗体、兔抗人HSP90多克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司；鼠抗人MHCⅠ类分子(HLAABC)mAb、鼠抗人MHCⅡ类分子（HLADR）mAb购自华美公司；WesternBlot试剂盒（包括酶标记二抗、A液和B液）购自Pierce公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天生物技术研究所.

1.2方法

1.2.1细胞培养采用机械分散法获得肿瘤细胞悬液：将肿瘤组织剪成5～10mm3的小块组织，弃去结缔组织、坏死组织、血管等.轻轻挤压肿瘤组织过100目的筛网，悬液再过200目筛网，将所得的细胞悬液置于含2mmol/LL谷氨酰胺和青霉素1×105U/L、链霉素100mg/L的无血清RPMI1640全培养液中，于37℃含50mL/LCO2细胞培养箱中常规培养，隔日传代,待细胞生长至对数期时，收集上清液.用25g/L胰酶消化收集细胞，用PBS洗涤重悬，调整细胞浓度为1×1010/L.实验均用对数生长期的细胞.

1.2.2exosomes的获得分别取腹水和细胞培养上清液，以300g离心5min，取上清液；以800g离心30min，去沉淀；再以10000g离心40min，取上清液；加入Centriplus超滤离心管中，以1500g离心1h，取浓缩液.将30g/L的蔗糖/重水垫、浓缩液和10mmol/LPBS依次放入离心管中，低温下以100000g超速离心1h.取出混有exosomes的蔗糖/重水垫,10mmol/LPBS悬浮，加入AmiconUltra高回收率高流速切向流超滤离心管中,以1500g离心30min，重复3次.取浓缩液用10mmol/LPBS悬浮成5mL，为待测液.记录离心和超滤次数，置于4℃冰箱中保存备用.

1.2.3exosomes的鉴定

1.2.3.1电镜将待测液各取20μL滴于载样铜网上，于室温静置1min；用滤纸从侧面吸干液体，滴加20g/L磷钨酸（pH6.8）约30μL于铜网上，室温负染1min；用滤纸吸干负染液，在白炽灯下烤干后，于透射电镜下观察，并照相.