方案23.10 口腔角质形成细胞
实验材料 | D-PBSA0.17%胰蛋白酶PET 试剂、试剂盒 | 转运培养液生长培养液含抗菌素的生长培养液手术刀和11号刀片眼科剪眼科镊2把50mm或100mm培养级Petri培养皿35mm和100mm非培养级Petri培养皿15ml锥形离心管微量加液器涂有FNCBSA的50mm培养皿 实验步骤 | 一、原代培养 1.取手术切除或早期活检组织,将组织放入转运培养液(LeibowitzL-15培养液,添加100μg/ml庆大霉素、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和1μg/ml两性霉素B),尽快送到实验室。 2.将组织移入100mm培养皿,用P-PBSA(不含Ca2+和Mg2+的DulbeccoPBSA)浸洗。 3.尽量切除结缔组织和有血液部分。如果组织标本的表面面积≥1cm2,将其切成小块。 4.将组织块放入35mm培养皿,然后加入足够0.17%胰蛋白酶液(用P-PBSA配制),覆盖组织块。在4°C条件下孵育过夜。 5.用一把镊固定组织块,用另一把镊将上皮剥离入胰蛋白酶液。 6.将组织悬液轻轻研磨几次,使细胞进一步分散。然后,将细胞悬液移入离心管。 7.用D-PBSA浸洗培养皿,然后将浸洗液加入细胞悬液。浸洗用量同步骤4组织消化的胰蛋白酶液。 8.用微吸管吸取一等份测定细胞产量。 9.在4°C条件下离心(125g),最好用制冷离心机。用生长培养液混悬细胞。 10.按要求用含抗菌索的生长培养液(生长培养液添加100μg/ml庆大霉素、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和1μg/ml两性霉素B)稀释细胞悬液,然后将细胞接种于涂有FN/C/BSA的50mm培养皿,密度为5×103个/cm2。 11.24h后换培养液,以除去细胞碎片和红细胞。 12.隔天换液。 二、传代培养 13.用D-PBSA浸洗细胞。 14.加入PET液(含有1%聚乙烯吡咯酮(PVP,40KDa)、0.5mmol/LEGTA和0.025%胰蛋白酶,用D-PBSA配制),完全覆盖细胞,如在100mm培养皿加入3ml。 15.在室温下孵育,直至细胞变圆或从培养皿去附着。在显微镜下观察细胞去附着情况,此过程一般需要1.5min。可通过加入高浓度胰蛋白酶或在37°C条件下消化提高去附着效率。 16.当大多数细胞去附着时,轻弹培养皿和用胰蛋白酶液吹打细胞,以机械性地加强去附着。 17.细胞去附着后,向培养皿加入5~10mlD-PBSA,终止胰蛋白酶的消化。 18.将细胞悬液注入离心管,轻轻研磨,以使细胞充分混悬。 19.用1ml吸管取细胞悬液,加入血细胞计数板,计数细胞。 20.计算悬液中细胞密度。 21.在4°C条件下离心(125g,5min)。 22.吸去上清液,用手指轻弹离心管,直至沉下的细胞分散。 23.加入适量生长培养液,用吸管轻轻混悬细胞,然后将细胞悬液注入培养皿。 24.将全部培养皿放入浅盘内,用手移动浅盘,并变化移动方向,从而摇动培养皿。注意保证每个培养皿中的细胞密度均匀,即摇动培养皿时集中于培养皿中心。另外,应注意将放培养皿的架平坦固定于孵育箱,孵育箱不能振动,以免细胞在贴壁过程中分布不均匀。 25.将细胞静置孵育4~24h,然后换培养液。 |
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发布于 : 2018-08-10
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