RAPD（随机扩增多态性DNA）分析技术一RAPD分析技术
| 实验方法原理 | RAPD作为单引物的PCR扩增产物，其产生机理是引物首先结合到模板链，沿模板5’端方向延伸而产生不同长度的DNA片段，然后以这些片段为模板继续大量扩增。由于RAPD反应中，在3’端没有相应引物和模板互补，这样必然存在一个由引物沿模板DNA5’端方向延伸后再在3’端形成同一引物互补序列的过程。 有人提出，在RAPD反应过程中，扩增可能存在一些这样的分子模式： （1）5’端带有引物的单链DNA分子在3’端发生折转、自身结合和延伸，并在3’端形成同一引物的互补序列，变性展开后即可成为单引物PCR扩增的模板分子。 （2）通过两条5’端各带同一引物的单链DNA分子拼联来实现。 （3）对基因组DNA分子的颠倒重复序列而言，如果引物的结合位置正好处于这些序列的3’端，那么在其DNA片段的两条单链上就分别具有一个引物的结合位置和它互补的序列，成了RAPD扩增的模板分子。在双引物通用PCR中这种情况很少，但由于RAPD所用引物短，又在低温下退火，这增加了引物和颠倒重复序列结合的机会，完全有可能产生RAPD。 | ||||||||||
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| 实验材料 | 模板DNA 试剂、试剂盒 | 寡核苷酸引物dNTPsTaqDNA聚合酶PCR缓冲液矿物油电泳所需试剂 仪器、耗材 | PCR扩增仪电泳装置微量离心机微量移液器Eppendorf管紫外线观察装置及照相设备 实验步骤 | 一、试验条件 1. 药品试剂 （1）模板DNA（10～100ng） （2）寡核苷酸引物（20mmol/L贮存液，可向OperonTechnologies或PerkinElmer公司购买，也可以自己合成） （3）0.2mmol/LdNTPs（必须使用高质量的dNTPs，这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等） （4）TaqDNA聚合酶（PerkinElmer，Norwalk，Connecticut） （5）10×PCR缓冲液（500mmol/LKCl，15mmol/LMgCl2，100mmol/LTrisHCl，pH8.3） （6）矿物油 （7）电泳所需试剂 2. 仪器设备 PCR扩增仪、电泳装置、微量离心机、微量移液器（1～20ml和20～200ml）、0.5mlEppendorf管、紫外线观察装置及照相设备。 二、操作程序 1. 在冰里向无菌的Eppendorf管中加入以下反应物： 水：14.75ml 10×缓冲液：2ml 10×dNTPs：2ml 引物（20mmol/L）：0.2ml TaqDNA聚合酶 终体积 DNA（10～100ng）：1ml 石蜡油：20ml 2. 93℃反应2min后开始如下循环： 93℃变性反应：1min 36℃退火反应：1min 72℃延伸反应：1.5min 经过45个循环后，最后一个循环72℃增加5min，循环结束后反应产物置于4℃保存。 3. 20ml反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况。 注意事项 | 其他 | 一、应注意的问题及解决办法 1. 扩增偏差或无扩增。 （1）在部分或全部管中缺少一个组分。重复少量几个反应以确定所有的PCR组分是否都已加入。 （2）PCR抑制物可能与DNA一起纯化，改变DNA的浓度。 （3）在DNA分离中加入一个清洗步骤（如苯酚抽提）。 （4）稀释新的DNA溶液。 （5）引物母液失效。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物浓度。 （6）延长退火时间（在PCR程序中的第二部分），或降低升温转换步骤之间的速率。 （7）提高每个反应中的Taq聚合酶的浓度。 （8）补加新的组分，该灭菌的都高压灭菌。 2. 扩增结果差，条带模糊或难以辨认。 （1）更换Taq聚合酶缓冲液。 （2）检查引物（使用另外一个引物，或者将引物末端标记，在16%6mol/L尿素聚丙烯酰胺胶上电泳检测）。 （3）检查Taq聚合酶活性（与不同批量的酶作比较）。 （4）改变DNA浓度。 3. 高相对分子质量产物弥散状分布>4kb。 （1）降低DNA浓度。 （2）降低Taq聚合酶浓度。 （3）减少凝胶上样量。 （4）可能是由于循环数过多的结果（Bell和Demarini1991），减少循环数。 （5）确认是否使用正确的缓冲液（不是水！）制备凝胶。 （6）在较低的电压下电泳。 4. 对照和所有检测样品中均为一条很强的单一带。 确认引物序列不是回文结构。这可能是引物多聚体造成的结果。使用不同的引物。 5. 带谱不可重复。 DNA过多或过少。把基因组DNA浓度控制在10～100ng范围之内，DNA量太少时，“真正”靶序列与引物的结合效率低，因此引物扩增会产生假的条带，这就称为引物伪迹；DNA量太多会导致错误配对（指引物与基因组DNA的配对）。每个样品进行两个不同DNA浓度的反应。只考虑主要条带。 6. 染色后凝胶背景太强影响分辨率。 （1）减少染色时间。 （2）凝胶脱色时间延长。 （3）PCR反应中DNA含量或Taq聚合酶过多。 7. 低相对分子质量产物分离不充分。 在更高浓度的琼脂糖凝胶、专业纯凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。 |
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发布于 ： 2021-09-08
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