从大规模裂解物中制备λ噬菌体颗粒实验
| 实验方法原理 | 从大规模培养物中制备的λ噬菌体，可在高盐存在下用聚乙二酵(PEG)沉淀的办法从裂解物中回收得到。残余的细胞碎片和PEG可用氯仿抽提。在进一步纯化之前，建议测定噬菌体制备物的得率。 | ||||||
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| 实验材料 | 大肠杆菌培养物 试剂、试剂盒 | 氯仿NaCl聚乙二醇SM胰DNaseⅠ 仪器、耗材 | SorvallGSA转子或相当型号量筒 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 氯仿，NaCl(固体），聚乙二醇（PEG8000)（每500ml培养物大约用50g），SM。 2.酶和缓冲液 胰DNaseⅠ(1mg/ml)，胰RNase(1mg/ml)于TE中（pH7.6)。 3.离心机和转子 SorvallGSA转子或相当型号。 4.专用设备 量筒（2L)。 5.载体和菌株 大肠杆菌培养物，经λ噬菌体感染和裂解。 二、方法 用PEG沉淀噬菌体颗粒 1.将含有λ噬菌体的裂解培养物冷却至室温，加胰DNaseⅠ和RNase至终浓度均为1μg/ml，室温温育30min。 2.每500ml培养物加入29.2g固体NaCl（终浓度为1mol/L)，搅拌使其溶解。将培养物冰浴1h。 再用PEG沉淀噬菌体颗粒中，NaCl的加入促进了噬菌体颗粒与细胞碎片之间的分离，因此是有效沉淀所需的。一些研究人员喜欢在加入PEG的同时加入NaCl，那样的话步骤3的离心过程可被省略。但需要告知的是，只有当噬菌体生长良好且其在最初裂解培养物中的滴度大于2X1010pfu/mI时，PEG和NaCl的同时加入才能有效地沉淀噬菌体颗粒。 3.4℃，11000g(8300r/min于SorvallGSA转子中）离心10min以去除细胞碎片，将四份培养物的上清混合置于2L的干净量筒中。 4.测定所收集上清的总体积，然后转移至2L的烧瓶中，加固体PEG至终浓度为10%(m/V，如500ml上清加50gPEG)，于室温用磁力搅拌器慢慢搅拌溶解PEG。 5.将噬菌体/PEG溶液转移至聚丙烯离心管中，于冰水浴冷却，至少放置1h以便使噬菌体颗粒发生沉淀。 6.4℃，11000g(8300r/min于SorvallGSA转子中）离心10min以回收沉淀的噬菌体，去上清，将离心管倒过来倾斜放置5min，以便使剩余液体充分流干。用移液器吸去残余的液体。 用氯仿抽提细菌碎片 7.用一带橡皮球的宽口吸管将噬菌体沉淀轻轻地重悬于SM中（针对步骤3每500ml上清加8mlSM)，将离心管倾斜放置，使SM完全覆盖并浸泡噬菌体沉淀，室温放置1h。 彻底但温和地冲洗整个离心管壁，因为噬菌体沉淀会黏附在管壁上，尤其当离心管比较陈旧有凹痕时。而如果剧烈地吸取噬菌体，容易造成其尾部的断裂。 8.通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬浮液中的PEG和细胞碎片，温和振荡30s。4℃，3000g（4300r/min于SorvallGSA转子中）离心15min以分离有机相和亲水相，回收含噬菌体颗粒的亲水相。 为了测定得率，用凝胶电泳分析噬菌体悬浮液。 |
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发布于 ： 2018-08-03
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