一、酵母DNA微量制备（40ml)

1.在125ml三角瓶中用40mlYPD培养液在30°C条件下培养细胞达最大生长量（过夜)。

2.将上述培养物移入螺盖离心管，用医用离心机或SarvallSS-34转头以5000r/mm离心5min，弃去上清液。

3.将细胞悬浮在3ml的0.9mol/L山梨醇-0.lmol/LNa2EDTA(pH7.5)溶液中。

4.加0.lml的2.5mg/ml消解酶100T，置37°C保温lh。

5.用医用离心机或SorvallSS-34转头以5000r/min离心5min，弃去上清液。

6.将细胞重悬于5ml的50mmol/LTris-HC1(pH7.4)-20mmol/LNa2EDTA溶液中。

7.加0.5ml的10%SDS，混匀。

8.置65°C保温30min。

9.加1.5ml的5mol/L乙酸钾溶液，在冰浴中放置lh。

10.用SorvallSS~34转头以10000r/min离心lOmin。

11.将上清液转移至干净的塑料离心管中，室温下加入两倍体积的95%乙醇，混勻，以5000?6000r/min室温离心15min。

12.弃上清液，将沉淀物干燥，然后悬浮在3mlTE缓冲液（PH7.4)中，此操作可能需要几个小时。

13.用SorvallSS-34转头以10000r/mm离心15min，将上清液转移到一个新试管，弃沉淀物。

14.加入150jul的lmg/irilRNaseA溶液，在37°C下保温30mino

15.加入一倍体积的100%异丙醇，轻轻混匀。取出呈松散纤维状的沉淀物，无需离心，让其自然干燥。

16.将沉淀物悬浮在0.5mlTE缓冲液（pH7.4)中，置4°C保存。酵母DNA的终浓度大约在ZOOjug/ml。如果最后的溶液不澄清，用异丙醇再次沉淀DNA或用SorvallSS-34转头以10000r/min离心15min。

二、酵母DNA微量制备（5ml）

1.接种酵母于5mlYPD中，置30°C培养过夜。

2.用医用离心机以2000r/min离心5min沉淀细胞，弃上清液。

3.将细胞悬浮在0.5ml的lmol/L山梨醇-0.lmol/LNa2EDTA(pH7.5)缓冲液中，并转到一支1.5ml离心管中。

4.加入0.02ml的2.5mg/ml的消解酶100T溶液，置37°C保温lh。

5.离心lmin。

6.弃上清液，把细胞用0.5ml的50mmol/LTrls-Ha(pH7.4)-20mmol/LNa2EDTA溶液悬浮。

7.加0.05ml的10%SDS，混匀。

8.置65°C保温混合物30min。

9.加0.2ml的5mol/L乙酸钾，把离心管在冰浴中放置lh。

10.离心5min。

11.将上清液转移到一洁净微型离心管，室温下加入等体积的无水异丙醇，混匀，放置5min。短暂离心（10s)弃上清液，让沉淀自然干燥。

12.用0.3mlTE缓冲液（pH7.4)重新悬浮沉淀。

13.加15ul的lmg/ml的RNaseA溶液，置37°C保温30min(此步可任意选择）。

14.加0.03ml的3mol/L乙酸钠，混匀，用0.2ml的无水异丙醇沉淀，再短暂离心收集DNA。

15.弃上清液，自然干燥，用0.1~0.3mlTE缓冲液（pH7.4)重新悬浮DNA。

16.在使用限制性内切酶酶解DNA之前，有必要将最终溶液离心较长时间（15min)以便除去可能抑制酶解的不溶性物质。

三、10min制备酵母DNA

大肠杆菌或酵母转化质粒的制备

1.在质粒DNA选择性培养基（如SC-ura)中，置30°C培养少量培养物（至少1.4ml)过夜。

2.将培养物转人一支1.5ml的微型离心管，离心5s，收集细胞。

3.小心倾去上清液，轻弹离心管，使沉淀重新悬浮于残余培养液中。

4.加人0.2ml的2%TritonX-100，1%SDS，100mmol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl(pH8)，lmmol/LNa2EDTA;加入0.2ml的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1);加人0.3g酸洗过的玻璃珠。

5.振荡2min。

6.离心5min。

7.用1~5ul含DNA的水相转化0.2ml的大肠杆菌受体菌，用15W水相转化酵母菌。

用于Southern分析的基因组DNA分离

1.用YPD培养基，置30°C培养10ml酵母至最大生长量。

2.用医用离心机离心2mm，弃上清液，收集细胞，用0.5ml蒸馏水重新悬浮，将细胞转入1.5ml微型离心管中，离心5s收集细胞。

3.重复第2)步。

4.重复第2)步。

5.加0.2mlTE缓冲液（pH8)，振荡3~4min。

6.离心5mm，将水相移至洁净试管，加lml的无水乙醇，上下颠倒，混合均匀。

7.离心2min，弃上清液，悬浮在0.4mlTE缓冲液和3ul的10mg/mlRNaseA溶液，置37°C保温5mm,加入10；ul4mol/L乙酸铵和lml的无水乙醇，上下颠倒，混合均匀。

8.离心2min，弃上清液，自然干燥后，用50ul的TE缓冲液悬浮，每份样品用lOul进行Southern印迹分析，每份用量2~4ugDNA。

四、制备酵母基因组DNA:玻璃珠法

1.用5ml培养基（完全培养基或选择性培养基）在30°C下，摇床培养过夜。

2.转移培养物至13mmX100mm的玻璃离心管中，用台式离心机以1500r/min离心5min，收集细胞。

3.用3ml无菌水洗细胞，同上离心。

4.用500ul裂解缓冲液再次悬浮。

5.加入干净的玻璃珠（约1.5ml离心管的2/3体积）和25ul的5mol/LNaa。

6.以最高速振荡lmin。

7.以2000r/min离心2min。

8.用P-1000移液器转移上清液至1支1.5ml离心管。

9.加入500ul苯酰，振荡，离心lmin。用P-1000移液器吸取水相（上层），转移至洁净离心管，加入500ulSEVAG(氯仿：异戊醇，24:1)，同上振荡，离心，抽提。

10.加人lml预冷的95%乙醇，在-20°C下沉淀lh。

11.以最高转速离心5min沉淀DNA，弃上清液，用70%乙醇清洗，最后悬浮在250ulTE缓冲液中。

12.加的EDTA-Sark和5ul的蛋白酶K(10mg/ml)，至37°C保温30min。

13.加250ul5mol/L乙酸铵，重复9)、10)步骤。

14.收集DNA，用70%乙醇洗，悬浮于100ul的TE缓冲液（每个酶解反应使用约10ul）。