淋巴细胞增殖功能的测定实验
实验方法原理 | T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体,在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA),抗CD2、抗CD3McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖;而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体(SAC)、脂多糖(LPS,对小鼠有作用)则刺激B细胞发生增殖;美洲商陆(PWM)、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。最近发现,integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。目前临床上最常选用PHA刺激PBMC,根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入率测定T细胞的增殖水平。 | ||||||||
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实验材料 | PBMC 试剂、试剂盒 | 闪烁液RPMI1640CO2孵箱 仪器、耗材 | 细胞收集仪β液闪仪 实验步骤 | 1. 无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC)洗涤后用10%FCSRPMI1640调整细胞数为1~2×106/ml 2. 加入96孔培养板中,1~2×105 细胞/100μl/孔,每组设3孔。加入最适剂量PHA,100μl/孔,同时设不加PHA阴性对照。如观察细胞因子(如IL-2)或其它刺激物(PMA)对增殖功能的调节作用,则根据加入因子的浓度而确定加入量,一般每孔最终体积为200μl,37℃、5%CO2孵育,66h 3. 每孔加入0.5~1μci 3H-TdR(50μl),继续培养6~12h 4. 用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品于"9999"型玻璃纤维滤纸上 5. 烤干后β液闪仪计数 6. 计算 (1)增殖水平直接用CPM值表示。 (2)也可用刺激指数(SI)表示 PHA(或实验组)cpm-机器本底 SI=─────────────── 阴性对照组cpm-机器本底 注意事项 | 1. 注意无菌操作。 2. PHA、ConA、PWM、LPS等在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。厂家和批号不同丝裂原作用常有很大差别,如Wellcome公司PHA终浓度最适剂量为1~3μg/ml,而广州医工所PHA约为20~100μg/ml。 3. 根据实验需要,对不同种(人、小鼠、大鼠、兔、狗等)不同来源淋巴细胞(胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃腺、外周血等)均应进行最适细胞浓度、圈养时间和刺激物浓度的摸索。 |
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发布于 : 2021-09-13
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