| 实验方法原理 | 对于细胞内蛋白的纯化和特性分析，重要的是选择一种有效的方法来破碎细胞或组织，使蛋白迅速地从胞内相对隔离的空间中释放到缓冲液中，而该缓冲液应对所研究的蛋白的生物活性没有影响。广泛使用的破碎软组织的方法之一是匀浆。蛋白酶从其他的细胞区隔中释放出来的风险很小。可以通过在匀浆缓冲液中加人蛋白酶抑制剂来降低蛋白酶的水解作用。匀浆缓冲液的选择取决于提取物的性质。一般使用中等离子强度、中性pH值（如0.05〜1.0mol/L磷酸盐或Tris，pH7.0〜7.5)。最适的缓冲液离子强度应该通过反复实验来优化，以获得目的蛋白的最高提取率。在许多情况下，匀浆缓冲液中加入蛋白酶抑制剂是没有必要的（因为目的蛋白周围有许多其他的蛋白，可以起保护作用）。但是一些蛋白比另外一些蛋白更易水解，并且一些组织（如肝、胰腺）比其他组织（如心脏）有更高水平的蛋白酶。若提取物的体积很大，使用混合蛋白酶抑制剂是昂贵的。因而，要进行几小时的预实验来确定目的蛋白是否大量丧失活性。假如蛋白酶水解有碍于实验，可以在匀浆缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。假如蛋白易于被氧化，或是活性被重金属抑制，则应在提取缓冲液中加入DTT(或β-巯基乙醇）和EDTA。 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 动物组织 试剂、试剂盒 | 二硫苏糖醇（DTT)匀浆缓冲液A匀浆缓冲液B 仪器、耗材 | 匀浆器离心机粗棉布 实验步骤 | 方法要点：所有操作均在0〜4℃进行。 ①从动物中取出组织后，修剪并去除脂类和结缔组织，然后放入预冷的匀浆缓冲液A中。 ②用切刀把洗好的组织切成小块（如1cm方块），或者把这些组织放在绞肉机上搅两次。像肝脏、大脑、肾和心脏等组织很容易在韦林搅切器中破碎，但是骨骼肌和肺则很难，所以应在匀浆之前先用家用绞肉机来绞碎。许多纤维组织，比如哺乳动物胸腺，必须在匀浆之前冰冻以利于破碎（常用Ultra-Turrex匀浆器）。培养的哺乳动物细胞和少量的软组织（1〜5g)，比如脑，可以使用Dunce手动匀浆器（Dignam,1990)来匀浆。在所有情况下，都要4℃预冷匀浆器和玻璃容器，并且匀浆操作应该在冷室中进行。 ③将组织加入3〜4倍体积的匀浆缓冲液B中，然后转移到匀浆器中。 ④使用下面的方法来制备匀浆液。Potter-Elvehjem匀浆器：仪器设置在500〜1500r/min，匀浆组织数次，每次5〜10s。Dounce手动匀浆器：匀浆组织10〜20次。韦林搅切器：匀浆组织3〜4次，每次20〜30s，间隔10〜15% ⑤把匀浆液倒入玻璃烧杯，把烧杯放在冰上，在4℃条件下温和搅动匀浆液30〜60min，以便充分提取蛋白。实验提示：匀浆过程中不要起泡。 ⑥4℃条件下10000g离心10〜20min，除去匀浆液中的细胞碎片和其他物质。 ⑦过滤漏斗中铺两层纱布（或加一层玻璃棉）来过滤上清，除去漂浮在表面的脂类物质。小心地拧纱布以便获得最大量的滤液（称为“粗提液”）。 ⑧尽快用适当的分离方法和分析方法处理样 注意事项 | 匀浆缓冲液A 50mmol/LTris-Cl(pH7.5)，2mmol/LEDTA，150mmol/LNaCl，0.5mmol/LDTT 匀浆缓冲液B 50mmol/LTris-Cl(pH7.5)，10%(体积分数）甘油或（0.25mol/L蔗糖），5mmol/L醋酸镁，0.2mmol/LEDTA，0.5mmol/LDTT，1.0mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF) 其他 |  |
