| 实验方法原理 | |||||||
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| 实验材料 | 胶条 实验步骤 | 对一新样品，常最先使用宽范围、线性PH3.5-10梯度但对大多数样品，这样做会丧失pH4-7区域的分辦率，许多蛋白质的pI值在该区域。利用非线性pH3.5-10IPGIEF胶在一定程度缓解这个问题。PH3.5-10非线性胶条在pH4-7区域的梯度要比pH7-10更为平坦，保证大部分碱性蛋白质都能得到分离的前提下，pH4-7区域得到更好的分离（图3.2)但用pH4-7的IPGIEF胶则能在该范围得到更好的分离效果（图J,J)这些pH范围的胶条目前已经商品化,实验室自制pH4-9的IPG胶也能覆盖来自许多不同种类样品的大多数蛋白质。这些梯度的IPG胶与加样杯上杆或胶内泡胀兼容，仕Muhipho,和IPGphor系统都工作良好均适用于分析胶（上样量50-100μg)或微量制备胶（上样量至1mg）典型运行条件如表3.1和3.2所示。
当分析真核细胞提取物一类复杂的样品时，由于空间分辨率所限，而且高丰度蛋白质存在时低拷贝数蛋白质显色困难，使得单一宽范围pH梯度IFF只能显示该细胞提取物全蛋白质组的一小部分。可以克服真核及组织蛋白质表达高动态范围和多样性问题的一种方法是进行样品前期分级（见4.4)。另外一种有效的方案是利用复合重叠窄范围IPG凝胶，跨度在1-1.5pH单位，该方法被称为“放大胶"(zoomgel)、复合胶或亚蛋白质组学(subproteomics)。此外，也可用24cm的宽胶条。pH4-7之间的窄范围胶可用胶内泡胀或加样杯上样，在Multiphor或IPGphor仪器上运行（图3.4)。这些凝胶是用于毫克上样量微量制备的理想选择，但制备胶需要加长聚焦时间，见表3.1和表3.2)。强碱性蛋白质如核糖体和核蛋白的PI值在10.5到11.8之间，可以用pHl0-12或pH9-12窄范围IPG(图3.5)分离，要获得高重复性的2-DE图谱，必须对pH梯度生成和凝胶组成进行不同的优化，如用N,N"-二甲基丙烯酰胺取代丙烯酰胺，并在IPG泡胀液中加入异丙醇，从而抑制容易导致大量胶上条纹的反向电渗流。必须要用加样杯在阴极上样，且IEF要在硅油下进行。从基因组序列计算获得的理论2-DE图谱显示全细胞裂解所获得的大部分蛋白质等电点在pH4-9,但同时相当一部分蛋白质等电点可以达到pH12。在经典2-DE中这些蛋白质只能用NEPHGE分离（见3)"但用IPGIEF很容易将这些蛋白质分开。
具体作法是用上文所提到的窄范围pHl0-12或pH9-12的IPG,但为了要获得某个细胞或组织蛋白质组的全貌，要先制备覆盖pH3-12和pH4-12的宽范围IPG。目前已获得细胞和组织提取及TCA/丙酮沉淀蛋白质时通常在裂解缓冲液提取中缺失的PI值大于10的碱性蛋白质以及肺支原体中不溶于TritonX-100的细胞成分的良好的2-DE图谱。此外，在pH9和pH12间含一个平缓区的pH4-12IPG可以对如核糖体蛋白质类强碱性蛋白质获得极好分离。这些宽梯度可以在不含异丙醇的标准条件下运行，因为此时超过pH10的窄IPG胶中水合离子向阴极的强烈转移（反向电渗）特性可以忽略不计。此外，高分子质量蛋白质的渗入和聚焦也得到了明显改善（图3.6)。利用经典O"Farrell系统可以在宽分离距离（每个方向上超过30cm)上获得复杂蛋白质谱的最大分辨率。但是，若用IEF管胶技术，其成功则伴随着凝胶操作和处理过程中方便性的丧失。与此对比，在塑料支持膜上聚合的长IPG胶的处理不需要特殊注意之处。如覆盖pH3-12和pH4-12范围的24cmIPG胶条已成功使用（图3.6)。此外，利用窄范围pH值（如pH5-6)的24cm长IPG胶条可以获得高分辨2-DE图谱（图3.7)。
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